不同顯微CT成像在大鼠肺部形態(tài)及容積成像中的比較

王鳳卓 夏藝 李兵

1海軍軍醫(yī)大學附屬上海長征醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科200003；2海軍軍醫(yī)大學附屬上海長征醫(yī)院影像與核醫(yī)學科200003

動物實驗是研究各類疾病病理生理學的重要手段，既往評估小動物肺臟多采用組織病理學方式，結(jié)果確切可靠，也是其他檢查的金標準[1]。隨著影像學技術(shù)飛速發(fā)展，目前圖像的成像分辨率越來越高[2]。顯微電子計算機斷層掃描(microelectronic computed tomography，Micro-CT)受探測器特點、劑量、噪聲等多方面限制，既往多應(yīng)用于小動物骨骼成像、實體臟器成像領(lǐng)域，而肺臟成像研究較少[3-4]。Wistar大鼠因其良好穩(wěn)定的特性，是目前使用最廣泛的實驗大鼠，被廣泛應(yīng)用于呼吸、運動等各領(lǐng)域?qū)嶒炑芯縖5-7]。本研究選擇了Wistar大鼠肺臟組織，采用不同方法Micro-CT技術(shù)進行成像研究。旨在探討比較不同成像方法在形態(tài)學研究中應(yīng)用的潛力，并對比研究該顯微成像方法與組織病理學圖像的對應(yīng)關(guān)系，為動物實驗影像學成像評估提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性，Wistar大鼠10只，體質(zhì)量200～220 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證編號：201801868，飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院無特定病原(specific pathogen free level，SPF)級動物房，按晝12 h/夜12 h節(jié)律，自由進食飲水，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進行活體常規(guī)Micro-CT成像，成像完成后處死大鼠制作離體肺臟標本。

1.2 肺臟標本制備 實驗Wistar大鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉深度麻醉后，放血處死，小心剝離完整肺臟組織，浸泡10%甲醛溶液中固定48 h，然后置于35%(2.5 h)、50%(2 h)、75%(2 h)、85%(2 h)、90%(1.5 h)、95%(1 h/次，共2次)、100%(第1次1.5 h，第2次12 h，共2次)酒精中進行梯度脫水。脫水完成后將肺標本自然風干。

1.3 影像學檢查

1.3.1 活體常規(guī)Micro-CT成像 本實驗在軟昊生物科技(上海)有限公司動物實驗中心進行，機器型號為：Quantum FX Micro-CT。活體大鼠采用乙醚氣體麻醉，俯臥位，四肢攤開，頭先進，自由呼吸情況下進行全肺掃描。掃描參數(shù)為：管電壓90 k V，管電流88μA，分辨率72μm，可獲得大鼠胸部(包括完整肺臟、縱隔結(jié)構(gòu))成像。

1.3.2 離體標本常規(guī)Micro-CT掃描成像 本實驗在上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院動物實驗中心進行，機器型號：SCANCO uCT80 Micro-CT。將離體肺臟標本整體置于掃描平臺上，進行掃描成像。掃描參數(shù)為：管電壓70 k V，管電流144μA，分辨率18μm，可獲得大鼠整體肺臟標本成像。

1.3.3 離體標本常規(guī)高分辨率Micro-CT掃描成像 本實驗在上海束蘊儀器有限公司動物實驗中心進行，機器型號：Skyscan1172 Micro-CT。將離體肺臟標本切割，取感興趣部分標本切塊置于EP管內(nèi)固定，置于掃描平臺上進行掃描成像。掃描參數(shù)為：管電壓40 k V，管電流250μA，分辨率4.99μm，可獲得大鼠肺臟局部高分辨率成像。

1.3.4 離體標本基于同步輻射相襯高分辨率Micro-CT掃描成像 本實驗在上海光源(Shanghai synchrotron radiation facility，SSRF)X射線成像及生物醫(yī)學應(yīng)用光束線站(X-ray imaging and biomedical beam line/laboratory station，BL13W)進行，對大鼠肺臟標本切塊進行類同軸同步輻射相襯成像，以扭擺器插入件為光源，能提供能量范圍10～65千電子伏特(kilo electron volt，ke V)、光斑尺寸45 mm×5 mm的硬X射線高通量光子輸出。本實驗射線能量調(diào)節(jié)在16 ke V，曝光時間500 ms，樣品臺與探測器之間的距離為25 cm，電荷耦合器件(chargecoupled device，CCD)分辨率為5.2μm，對應(yīng)CCD視場為10.649 6 mm。

1.4 病理標本制備與評估 大鼠肺臟組織樣品的原位組織，再次甲醛浸泡48 h，行HE染色，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4μm，在光學顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，進行視覺評估。

2 結(jié)果

2.1 影像學結(jié)果

2.1.1 活體常規(guī)Micro-CT掃描結(jié)果 在分辨率72μm條件下，可獲得大鼠胸部整體成像，顯示肺野、縱隔及胸廓等胸部的大體情況，對全肺進行左、右肺的區(qū)分；分別可行橫斷面、冠狀面及矢狀面成像，重建后可得到肺臟平均密度；經(jīng)后處理后可獲得全肺水平的容積重建，得到肺臟總?cè)莘e圖像；氣管可顯示至3級支氣管水平；縱隔內(nèi)心臟及大血管可見，但淋巴結(jié)顯示不清，見圖1、2。

圖1 活體常規(guī)Micro-CT橫斷面圖像

圖2 活體常規(guī)Micro-CT矢狀位圖像

2.1.2 離體標本常規(guī)Micro-CT(全肺)掃描結(jié)果在分辨率18μm條件下，可獲得大鼠肺臟的整體成像。可對全肺進行肺葉水平的區(qū)分，顯示左肺呈2葉結(jié)構(gòu)，右肺呈4葉結(jié)構(gòu)；清晰顯示肺野內(nèi)橫斷面結(jié)構(gòu)，氣管可顯示至4～6級支氣管水平。局部放大后重疊肺泡隱約可見，三維重建后可以得到肺葉水平肺臟容積圖像，得到肺臟每個肺葉的容積，從而可更精確反應(yīng)局灶肺部形態(tài)和容積變化，見圖3。

圖3 離體常規(guī)Micro-CT冠狀位圖像

2.1.3 離體標本常規(guī)高分辨率Micro-CT(局部)掃描結(jié)果 在分辨率4.99μm條件下，受標本大小限制，僅可獲得大鼠肺臟局部成像，肺野斷面結(jié)構(gòu)顯示清晰，可顯示至呼吸性細支氣管水平，另能夠清楚顯示肺泡結(jié)構(gòu)，重建后可見完整肺泡結(jié)構(gòu)及終末細支氣管束結(jié)構(gòu)，見圖4。

2.1.4 離體標本基于同步輻射相襯Micro-CT(局部)掃描結(jié)果 分辨率為5.2μm條件下，基于同步輻射相位襯度顯微CT成像技術(shù)不僅可獲得與常規(guī)吸收顯微CT成像的大鼠肺臟標本局部高分辨率圖像，顯示較為清晰的終末細支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)，而且在不使用造影劑的情況下可以在肺臟標本中清晰顯示肺臟血管束結(jié)構(gòu)。可清楚區(qū)分局部肺葉的支氣管束分支、終末氣道及肺泡結(jié)構(gòu)，對比度強于常規(guī)吸收顯微CT，肺泡經(jīng)重建后可清晰顯示，經(jīng)amira軟件處理后可行三維重建顯示血管結(jié)構(gòu)、肺泡結(jié)構(gòu)，見圖5、6。

2.2 大鼠肺臟病理學檢查結(jié)果 成像后的原位肺組織切片后行HE染色，組織病理標本切片鏡下觀察可以清晰見到各級支氣管、肺泡等結(jié)構(gòu)，肺泡間隔結(jié)構(gòu)的局部斷裂、增厚清晰可見，局灶浸潤的炎細胞經(jīng)HE染色也可得到呈現(xiàn)，見圖7。

圖4 離體常規(guī)高分辨率Micro-CT局部成像

圖5 離體相襯Micro-CT局部成像

2.3 不同檢查方法間的比較

2.3.1 活體與離體大鼠全肺成像的比較 活體與離體大鼠全肺成像由于分辨率的不同，圖像質(zhì)量具有明顯差異，活體成像僅可顯示肺臟的大體情況，區(qū)分左、右肺，氣管可顯示至3級支氣管水平；而離體成像因為分辨率的提升，氣管可顯示至4～6級支氣管水平，局部放大后重疊肺泡隱約可見。活體成像也有獨特優(yōu)勢，可連續(xù)動態(tài)觀察肺臟情況，同時顯示縱隔內(nèi)心臟及大血管情況。

2.3.2 不同成像原理用于大鼠局部肺成像的比較(常規(guī)即X-射線透射吸收成像與基于同步輻射相位襯度成像) 在分辨率接近的水準——分別為4.99μm與5.2μm，常規(guī)Micro-CT與基于同步輻射相位襯度Micro-CT成像得到的大鼠肺臟橫斷面圖像均可清晰顯示肺臟局部細微結(jié)構(gòu)，可以清晰顯示終末呼吸性細支氣管，并可區(qū)分單層肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間隔清晰可見，經(jīng)后處理軟件后可行肺泡、支氣管的重建；相較常規(guī)Micro-CT，基于同步輻射相位襯度Micro-CT成像的對比度和清晰度更有優(yōu)勢，而且其經(jīng)后處理可得到肺臟血管結(jié)構(gòu)重建，而常規(guī)Micro-CT需要借助造影劑才可以實現(xiàn)血管重建；實驗耗時方面，基于同步輻射相位襯度Micro-CT成像的圖像處理較常規(guī)Micro-CT耗時更長。

圖6 離體相襯Micro-CT三維重建血管成像

圖7 相襯Micro-CT原位肺組織病理 HE ×40

2.3.3 同步輻射相位襯度Micro-CT成像與病理的比較 高分辨的同步輻射相位襯度Micro-CT成像與病理學均可以見到肺臟局部細微結(jié)構(gòu)，包括各級支氣管，尤其是終末呼吸性細支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)，均可清晰顯示肺泡間隔結(jié)構(gòu)，圖像視覺評估具有較高的一致性、對應(yīng)性和相關(guān)性，因此其具有了一定的互換性和可替代性。但相比較而言，病理學圖片經(jīng)放大后可進一步顯示炎性細胞浸潤情況，在細胞學層面仍然具有獨特優(yōu)勢。

3 討論

在動物肺臟影像學成像實驗中，肺部結(jié)構(gòu)形態(tài)及定量分析一直受到較廣泛的關(guān)注[8-11]。顯微成像技術(shù)的飛速發(fā)展給無損氣道形態(tài)測量提供了可能性。Micro-CT系統(tǒng)一般包括微焦斑X射線源、X射線探測器、旋轉(zhuǎn)機構(gòu)、控制器和圖像工作站等部件，獲得的圖像可以獲得幾何倍數(shù)放大，從而得到局部較高的成像分辨水準[12]。同步輻射光產(chǎn)生的硬X射線具有高亮度、高耀度、高準直性和高空間相干性等優(yōu)點，顯著提高了成像的空間分辨率[13]。

在本項研究中，首先通過常規(guī)Micro-CT對活體大鼠進行了胸部掃描成像，掃描得到的圖像可初步評估大鼠肺臟、縱隔及胸壁結(jié)構(gòu)，能夠動態(tài)觀察影像學變化，對于肺臟的一般炎癥性、腫瘤性病變具有相當程度的鑒別診斷價值；之后通過高分辨率的常規(guī)及基于同步輻射光源相位襯度Micro-CT成像技術(shù)，對離體大鼠肺臟分別進行掃描，圖像可以顯示大鼠肺臟實質(zhì)及間質(zhì)情況，包括主支氣管、支氣管各級分支、肺泡及肺臟血管，經(jīng)過后處理技術(shù)[14-15]可對肺臟容積、支氣管束及肺臟血管束進行測量。最后進行病理學[16]檢查，圖像經(jīng)量化分析可以測量肺泡直徑、平均內(nèi)襯間隔、微血管密度、支氣管管徑長度及管壁厚度等指標，且這些結(jié)構(gòu)特征與前期的高分辨率的常規(guī)及基于同步輻射相襯Micro-CT成像具有較好的一致性、相關(guān)性。這些研究顯示了無創(chuàng)Micro-CT成像技術(shù)在動態(tài)觀察實驗動物中的巨大優(yōu)勢，而高分辨Micro-CT與組織病理學的較好相關(guān)性，也使得其應(yīng)用具有相當前景。

動物活體影像研究中，Sasaki等[17]運用Micro-CT對不同香煙暴露時間(0、4、12及20周)的成年雌性C57BL/6J小鼠肺部進行掃描，其動態(tài)的定量結(jié)果較好的反映了隨著時間推移肺氣腫的發(fā)展過程，并與病理組織學檢查具有較好的相關(guān)性。Ruscitti等[18]通過使用博來霉素氣管內(nèi)滴注誘導(dǎo)小鼠纖維化的模型，Postnov等[19]對活體小鼠進行胰蛋白酶滴注構(gòu)建肺氣腫模型后，他們均對實驗動物進行常規(guī)Micro-CT進行活體掃描成像，對氣道和肺形態(tài)學改變進行評估和重建，評估了其在不同時間點肺臟病變進展，同時對應(yīng)完善組織病理學評估，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)Micro-CT數(shù)據(jù)與組織病理學具有良好的符合性。

動物離體肺臟影像研究中，F(xiàn)aight等[10]通過Micro-CT技術(shù)觀察了大鼠的肺部血管與氣道的關(guān)系。Chen等[11]通過Micro-CT技術(shù)進行了ALI大鼠的肺部微結(jié)構(gòu)的觀察，包括肺泡間隔的增厚、肺泡內(nèi)部的滲出等改變。Fuji等[9]通過實驗發(fā)現(xiàn)，在高分辨率同步輻射相襯Micro-CT成像下可以清晰觀察肺部小血管情況，并發(fā)現(xiàn)了肺動脈高壓時肺小血管的重構(gòu)。這些研究均體現(xiàn)了Micro-CT技術(shù)的成像優(yōu)勢，在高分辨率條件下，可觀察到肺臟細微形態(tài)結(jié)構(gòu)。

Barré等[8]通過高分辨率的同步輻射相襯Micro-CT成像觀察到了大鼠肺泡的數(shù)量的動態(tài)變化情況；Hwang等[20]也通過同步輻射相襯技術(shù)對大鼠終末氣道進行了重建觀察，測量了肺泡長徑、表面積等指標；Zhang和Luo[21]對新生大鼠的肺臟進行高分辨率的同步輻射相襯Micro-CT成像，經(jīng)amira后處理重建后可得到單個完整肺泡三維模型，并計算肺泡直徑及體積，以此精確重建肺臟容積。Fu等[22]通過高分辨率的同步輻射相襯Mirco-CT對大鼠肝臟標本進行了掃描，可以清晰顯示肝臟結(jié)構(gòu)，包括肝小葉結(jié)構(gòu)，并對肝臟血管束進行高分辨重建。

本研究結(jié)果表明，實驗動物活體常規(guī)Micro-CT成像技術(shù)操作簡單，耗時相對少，實際可操作性強，故其適于應(yīng)用于實驗動物學影像動態(tài)評價領(lǐng)域；而高分辨率的常規(guī)及基于同步輻射相位襯度Micro-CT成像，其可獲得高分辨率的肺臟結(jié)構(gòu)圖像，顯示肺臟細微形態(tài)變化，直至肺泡水平，且與組織病理學檢測呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性，故其不僅可應(yīng)用于肺部炎癥、腫瘤等各類疾病的評估，甚至在很大程度上對有創(chuàng)性的組織病理學檢查成為一種新型替代手段。在高分辨的常規(guī)及基于同步輻射相襯的Micro-CT掃描中，本實驗掃描對象是局部肺臟標本。在實驗中發(fā)現(xiàn)，標本的厚度、固定方法及成像X射線能量、樣品探測器距離及曝光時間等均可影響最終的成像質(zhì)量。根據(jù)標本的大小和厚度，選擇像素大小為5.2μm的CCD探測器、對應(yīng)視場10.649 6 mm為成像條件，X射線能量為16 ke V，樣品與探測器的距離為25 cm，曝光時間為500 ms。這是我們摸索出的基于同步輻射相襯Micro-CT較為理想的成像實驗條件。

本實驗的局限性：(1)由于同步輻射光源光斑視野的限制，本研究的成像視野較小，僅顯示了局部肺臟結(jié)構(gòu)。根據(jù)Kizhakke Puliyakote等[23]的研究，肺泡形態(tài)在胸膜下肺區(qū)與中部區(qū)有一定差異。這種不同部位(上下、內(nèi)外)形態(tài)結(jié)構(gòu)特點的異質(zhì)性，要求后續(xù)實驗應(yīng)在不同位置取材進行肺臟成像，觀察不同部位肺臟局部微結(jié)構(gòu)的變化；(2)本實驗是以甲醛溶液固定的離體生物標本為載體，進行肺臟結(jié)構(gòu)成像。鑒于目前尚無活體動物肺臟成像的報道，后續(xù)研究考慮采用深度麻醉下活體動物肺臟成像。目前該技術(shù)還不能應(yīng)用于臨床成像，但是基于傳統(tǒng)X線的大視野相襯成像研究已經(jīng)在開展中，同時，基于相位襯度成像的活體實驗研究也在進行中，隨著技術(shù)的發(fā)展，相襯成像將給醫(yī)學影像學帶來深刻變革，推動臨床醫(yī)學的發(fā)展。

本研究中所提出的常規(guī)Micro-CT成像技術(shù)可應(yīng)用于實驗動物的影像學動態(tài)監(jiān)測，而高分辨的常規(guī)及基于同步輻射相位襯度Micro-CT成像技術(shù)因其與組織病理學的高度相關(guān)性，有望成為其替代手段，發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)構(gòu)細微變化，為實驗動物影像學評估提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突