矮牽?；ㄋ幣囵B技術及影響因素的研究

張馨默，劉麗萍*

（1.黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心；2.黑龍江大學生命科學學院黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000）

花藥培養是利用植物組織培養技術，將花藥進行無菌操作接種到人工培養基上，通過改變小孢子的發育途徑，使其誘導分化，進行連續的有絲分裂，形成細胞團，繼而形成愈傷組織后胚狀體，最終分化成完整的植株。印度Guha等最早針對毛曼陀羅的離體花藥，誘導出單倍體植株，而后花藥培養法被運用到煙草上，并受到世界的廣泛關注。此后，人們陸續開展了對觀賞性植物的花藥培養研究。

花藥培養在育種中的應用價值：一是可縮短育種年限，加速育種進程。通過對獲得的單倍體植株進行染色體加倍，從而獲得純合的二倍體植株；二是對育種研究提供原材料。通過鑒定和選擇滿意的基因組合，對遺傳變異方面的研究提供了科學的理論依據；三是提供了外源基因的轉化受體，從而利于外源基因的整合與表達。

矮牽牛（Petunia hybrid Vilm），又名碧科茄、靈芝牡丹、撞羽牽牛等，為茄科矮牽牛屬一年生或多年生的半蔓性草本花卉。其品種豐富、系列繁多，包括阿根廷系列、云系列、夢幻系列、魅力系列、地毯系列、梅林系列等。因其具有鮮艷豐富的色彩、較長的花期和適應能力、較好的耐熱性及觀賞性，被廣泛地用于城市綠化和室內盆栽等。在種子的獲取方面所面臨的問題有：播種繁殖，采種困難；進口雜交種，價格昂貴；扦插繁殖，成活率低等。

因此，針對矮牽牛的需求量的增加以及需求品種的多樣化，通過花藥培養可快速獲得純合二倍體以及隱形突變體，并能縮短育種周期、提高選擇效率。而目前在矮牽牛花藥培養的技術研究方面還遠不如禾本科植物成熟，例如，水稻、小麥等。通過本試驗研究，旨在明確矮牽?；ㄋ幣囵B技術的最佳培養條件、總結有關花藥培養中的影響因素和培養過程中應注意到的問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選擇

以矮牽牛“梅林系列”紅色品種為試驗材料。于晴天上午10時從健壯無病毒的植株中采集花蕾，首先對小孢子發育時期進行觀察，通過醋酸洋紅染色，再進行壓片鏡檢，確定小孢子的發育時期與花蕾直徑的相關性。選取小孢子發育時期處于單核靠邊期的花蕾做試驗，花蕾直徑在1.5～2.0mm。

1.2 培養基與培養條件

MS、B5、N6 基本培養基與 2，4-D 、6-BA、NAA、IBA、IAA等生長調節劑按照不同比例混合，部分培養基中需加入瓊脂和麥芽糖，培養基pH值為5.8。培養室溫度為25±2℃，愈傷組織的誘導需要暗培養，愈傷組織分化的光照周期為14h/d，光照強度為3000lx。

1.3 預處理與接種

首先剝去花萼，用1 mol/L的HCL處理60s后用流水清洗數遍，再用70%乙醇浸泡2 min，流水沖洗干凈。用無菌蒸餾水沖洗3次，大約15 min。將處理后的花蕾剪下，放在4℃的恒溫冰箱中冷藏，冷藏時間設置4組對照，即12h、24h、48h、72h。之后在干凈無菌的實驗臺上，使用70%的酒精處理花蕾1 min，無菌水沖洗3次（約15 min）。最后用0.1%的HgCl2消毒，消毒時間設置 4組對照，即 6min、8min、10min、12 min，無菌水沖洗 5次（約30 min），后用吸水紙吸干花蕾表面的水分。接種前使用滅菌后的解剖刀或鑷子小心地剝去花瓣，取出花藥，去除花絲。將花藥散落接種到誘導培養基上，誘導培養基設置3種，即MS、B5、N6且與不同濃度的生長調節劑、瓊脂和麥芽糖混合配制，每個平皿中接種10個花藥，每個處理接種5瓶，用parafilm封口膜封好平皿，進行暗培養。每7d觀察一次愈傷組織的誘導情況，30d后統計最佳誘導培養基的誘導率。

1.4 愈傷組織的分化

愈傷組織誘導完成后，需在新配置的培養基（即3種基本培養基與生長調節劑混合配置）中進行光培養，每個瓶皿中接種5塊愈傷組織，每處理接種10瓶。每10d觀察一次愈傷組織的分化情況，30d后統計最佳分化培養基的分化率。

2 結果與分析

2.1 花蕾直徑與小孢子發育階段的關系

通過壓片鏡檢可觀察出：當花蕾直徑≤1.5mm時，小孢子處于四分體時期，此時的花藥呈綠色扁平狀；花蕾直徑在1.5～2.0mm時，小孢子處于單核靠邊時期，此時的花藥呈綠色略飽滿狀，適合做培養材料；當花蕾直徑≥2.0mm時，小孢子處于雙核時期，此時的花藥逐漸變成黃色呈飽滿狀。

2.2 冷藏時間對愈傷組織誘導率的影響

接種前，對花藥進行低溫預處理，有利于提高愈傷組織的誘導率。試驗表明，隨著冷藏時間的增加，誘導率呈先升高后降低的趨勢。在4組對照組中，冷藏48h后的誘導率最高，達27.54%。48h后誘導率降低的原因可能是花藥失水受損而導致營養物供不應求。

2.3 0.1%HgCl2的消毒時間對花蕾污染的影響

對花蕾進行HgCl2滅菌消毒，可減少污染、預防花藥受損。試驗結果顯示消毒時間與花蕾的污染率呈反比，最終可達到零污染的效果。但是HgCl2存在毒性，對花蕾作用時間過長會毒害細胞。消毒10 min為最佳滅菌時間，此時的污染率基本降低到10%左右，污染率較低且對細胞基本無損傷，也可保護花藥免受污染。

2.4 不同碳源對愈傷組織誘導及分化的影響

不同種類的培養基中分別添加蔗糖、麥芽糖、白砂糖作為碳源，對比愈傷組織誘導及分化效果好的碳源種類與濃度。試驗得出麥芽糖對提高愈傷組織的誘導率最明顯，當麥芽糖的濃度為20g/L時的誘導率為29.02%，其次是蔗糖，而白砂糖的效果不佳。

2.5 不同基本培養基對愈傷組織誘導及分化的影響

培養基的種類對花藥愈傷組織的誘導、分化起著重要的作用。本試驗通過對N6、B5、MS三種基本培養基的比較研究，篩選確定出最適合誘導出愈傷組織的培養基N6，其誘導率最高，而B5培養基的誘導率則不是很明顯，MS培養基的誘導率比較適中。對于最適分化培養基的選擇，試驗表明MS基本培養基比N6基本培養基的分化率高，愈傷組織的分化效果明顯。

2.6 參與配制的生長調節劑的種類與濃度對誘導率及分化率的影響

生長調節劑是通過很低的濃度來促進或抑制植物生命活動中的某些過程，所以往往起到量小作用大的效果，本試驗中所用到的生長調節劑包括：生長素2，4-D、IBA、IAA，細胞分裂素6-BA、NAA。在比較不同濃度的生長調節劑組成中，發現對于愈傷組織誘導培養基的最佳組合為N6+1.5mg/L 6-BA+1.0mg/L IBA其誘導率可達36.82%，此時其基部可產生大量的愈傷組織；而對于分化培養基的最佳組合為MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA其分化率可達43.75%，此時愈傷組織分化出芽量較高并且可保持褐化量較少。誘導培養基與分化培養基的配制方法，見表1及表2。

表1 N6誘導培養基配方（單位：g/L）

表2 MS分化培養基配方（單位：g/L）

試驗表明，生長調節劑的濃度不能過高，當其超出一定值時就會抑制愈傷組織的誘導效果或分化效果。如細胞分裂素6-BA對提高愈傷組織的誘導率有顯著的效果，但是當其濃度高于1.5mg/L時又會抑制愈傷組織的形成。

3 結論

本試驗通過一系列的對照研究，確定出矮牽?；ㄋ幣囵B的誘導培養基與分化培養基的培養配方。其中，在培養過程中起重要作用的有對花藥的選擇方面、對花藥接種前的處理方面，以及對培養基配制中各成分與濃度劑量的確定方面。研究得出：花蕾直徑在1.5～2.0mm的花藥處于單核靠邊期的較好；預處理中，冷藏溫度在4℃、時間在48h，滅菌時間在10min為宜；培養基中的碳源選擇麥芽糖對提高愈傷組織的誘導率效果比蔗糖和白砂糖明顯；生長調節劑針對不同作用的培養基的選擇和濃度確定是不同的，誘導培養基中需1.5mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA，分化培養基中則需0.5mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA。

矮牽牛花藥培養成功的關鍵在于培養過程中的無菌操作。一是保證花藥的無菌獲取，即在對花蕾進行預處理消毒滅菌時，應保持實驗臺的超凈無菌。而且牽?；ǖ幕ɡ俦砻姘欢探q毛，易受污染，所以應保證對花蕾或花藥進行轉移時周圍環境的潔凈無菌、無污染；二是保證對誘導后的愈傷組織進行分化培養基轉移時的無菌操作。

不同梯度的對比試驗組是研究有關影響因素的重要方法，其中涉及控制唯一變量的原則，以及試驗現象的定期觀察、試驗結果的判斷與數據計算。本試驗中涉及到數據計算包括：誘導率=成功誘導的愈傷組織數量/接種花藥的數量；分化率=成功分化的愈傷組織數量/接種愈傷組織的數量。

一是花藥培養可實現矮牽?；ǖ目焖倥嘤⒖s短其繁殖周期，但仍存在繁殖率低的問題。主要原因在于部分花胚的發生率較低，從而降低了其應用價值，所以有待于針對其基因方面進行深入研究；二是在小孢子的發育調控機理方面的研究還不夠成熟，若能明確此方面的機理，將有助于進行對目的性狀的篩選，可增加定向突變；三是花藥培養過程難免會受矮牽牛植物本身的體細胞影響，可通過適當的改變生長調節劑的種類和碳源的濃度來減緩其影響，但對于解決問題的關鍵仍需進一步的深入研究。