河源地區(qū)3879例非綜合征型耳聾致病基因突變分析

劉曉燕，鄔麗紅，曾秋娜，劉運(yùn)華

(河源市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東 河源 517000)

遺傳性耳聾屬于常見(jiàn)的先天性疾病，多因單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起，醫(yī)療、環(huán)境、創(chuàng)傷、藥物等為主要的客觀誘發(fā)因素[1]。遺傳性耳聾具有較高的發(fā)病率，是威脅人們健康的重要疾病之一。相關(guān)調(diào)查[2]數(shù)據(jù)顯示，在我國(guó)殘疾人口中，超過(guò)2780萬(wàn)為聽(tīng)力殘疾者，占全國(guó)8296萬(wàn)殘疾人的31%，占世界聽(tīng)障人群的25%。另有數(shù)據(jù)[3]調(diào)查顯示，世界各國(guó)每新出生1000名新生兒，便有1名為先天性耳聾患兒。在此背景下，必須加強(qiáng)遺傳性耳聾的防治工作，以降低遺傳性耳聾的發(fā)病率。因此，加強(qiáng)對(duì)遺傳性耳聾相關(guān)致病因素的分析至關(guān)重要。本研究納入河源市婦幼保健院2018年7月至2019年6月的3879例非綜合征型耳聾患者，分析致病基因突變情況。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

3879例非綜合征型耳聾患者，男2094例(53.98%)，女1785例(46.02%)，其中3847例是新生兒，采集的標(biāo)本有90%以上是臍帶血。根據(jù)患兒的發(fā)病情況、病史和全面的影像學(xué)檢查結(jié)果，結(jié)合病狀表現(xiàn)和體征，均確診為非綜合征耳聾。排除聽(tīng)力下降外伴有其他臨床癥狀者和綜合征型耳聾患者。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)物品

全血基因組提取試劑盒購(gòu)自潮州凱普生物化學(xué)有限公司，PCR-導(dǎo)流雜交法耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒(離心柱型)、PCR擴(kuò)增儀ABI7300購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，醫(yī)用核酸分子快速雜交儀HHM-2、核酸分子雜交儀HB-2012A購(gòu)自廣東凱普生物科技股份有限公司。

1.2.2 DNA分離提取

患者或其監(jiān)護(hù)人獲悉耳聾相關(guān)知識(shí)后，抽取被檢測(cè)者臍帶血或外周靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，取血液100 μL，采用凱普全血基因組提取試劑盒(離心柱型)提取基因組DNA,使用分光光度計(jì)檢測(cè)純度，滿足OD260/280=1.7～2.0，取2 μL抽提好的DNA樣本作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，剩余DNA樣品保存于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 PCR-導(dǎo)流雜交法

對(duì)標(biāo)本破裂細(xì)胞膜以釋放DNA，在高濃度鹽溶液中將核酸吸附在硅類介質(zhì)表面，并在低鹽濃度中將洗脫下來(lái)的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GJB2、GJB3、mtDNA和SLC26A4基因引物參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]設(shè)計(jì)。1)擴(kuò)增體系：2組PCR混合液各27.5 μL，主要成分包括Buffer、dNTPs、氯化鎂；Taq酶1 μL(5 U·μL-1)，ddH2O(50 mL)。擴(kuò)增程序：①95 ℃變性 9min；②95 ℃變性30 s，55 ℃溫度下退火30 s，72 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)；③72 ℃延伸5 min；降溫至16 ℃擴(kuò)增完成。2)雜交體系：雜交液(SSC、0.1%SDS),洗脫液WBI(SSC、0.1%SDS)，封阻液(TBS、脫脂奶粉、吐溫-20)，酶標(biāo)液(鏈霉親和素堿性磷酸酶)，溶液A(TBS、吐溫-20)，雜交膜(氨基化探針、尼龍膜)，顯色液(NBT/BCIP)。雜交過(guò)程：①95 ℃變性5～10 min，冰水浴至少2 min；②45 ℃導(dǎo)流雜交。3)顯色分析結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS12.0軟件處理數(shù)據(jù)，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非綜合征型耳聾致病基因檢測(cè)結(jié)果

3879例非綜合征型耳聾患者中，檢測(cè)出致病基因攜帶患者148例，檢出率為3.82%。

2.2 各種攜帶基因突變攜帶情況的分析

在致病基因攜帶率方面，GJB2和SLC26A4高于GJB3和mtDNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GJB2和SLC26A4相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GJB3和mtDNA相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各種攜帶基因突變攜帶情況的分析

3 討論

50%患兒的耳聾與遺傳因素有關(guān)，70%的遺傳性耳聾不伴有其他癥狀，稱為非綜合征性耳聾；非綜合征耳聾是最常見(jiàn)的感音神經(jīng)性聾，可以分為四類，分別為線粒體遺傳性耳聾(1%)、性連鎖(DFN X-linked，1%)、常染色體顯性(DFNA，15%～20%)和常染色體隱性(DFNB，80%)[5]。相關(guān)研究[6]表明，絕大部分的遲發(fā)性聽(tīng)力下降患者中，其致病因素中包括自身基因缺陷所致，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對(duì)致聾環(huán)境因素易感性增加而致病。我國(guó)遺傳性耳聾患者所涉及的主要是線粒體DNA(mtDNA)、SLC26A4、GJB2和GJB3 4種基因的突變。其中，mtDNA基因突變主要包括1494M、1555M、7445M和12201M；SLC26A4基因突變主要包括IVS-M、1229M、2168M；GJB2基因突變主要包括35M、155M、176M、235M和299M；GJB3突變主要以538M為主。

遺傳性耳聾有很高的遺傳異質(zhì)性，與耳聾相關(guān)的基因至少有100個(gè)，這給臨床檢測(cè)帶來(lái)了很大的困難。目前，傳統(tǒng)基因診斷方法中。酶切、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、變性高效液相色譜分析等是較為常見(jiàn)的診斷方法，盡管具有良好的診斷效果，但是也存在相應(yīng)的局限，如不能定性、耗時(shí)費(fèi)力、所需設(shè)備和耗材昂貴等，最為重要的是難以同時(shí)對(duì)不同基因的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)[7]。以APEX、Invader等芯片檢測(cè)技術(shù)為例，可以同時(shí)針對(duì)數(shù)百個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行高通量檢測(cè)，但檢測(cè)周期最長(zhǎng)可達(dá)8周，而且檢測(cè)成本相對(duì)較高，對(duì)除點(diǎn)突變之外的其他突變類型的檢出能力有限，PCR-導(dǎo)流雜交法采用生物素標(biāo)記的引物分別對(duì)耳聾基因突變區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記不同突變類型耳聾基因探針的尼龍膜在導(dǎo)流雜交儀上進(jìn)行導(dǎo)流雜交，然后通過(guò)化學(xué)顯色對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀[8]。

本研究針對(duì)PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)檢測(cè)河源地區(qū)4種耳聾易感基因，通過(guò)分析被檢者的DNA，確認(rèn)與耳聾相關(guān)的基因是否存在，取得了理想的效果。研究結(jié)果顯示，經(jīng)PCR-導(dǎo)流雜交法檢測(cè)出致病基因攜帶患者148例，檢出率為3.82%。進(jìn)一步分析各基因突變攜帶率，發(fā)現(xiàn)GJB2和SLC26A4攜帶率比較高，均超過(guò)了40%，并且遠(yuǎn)高于GJB3和mtDNA的攜帶率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這可為耳聾的臨床診斷提供依據(jù)，對(duì)致聾基因的尋找和檢測(cè)有著重要的意義。

綜上所述，河源地區(qū)非綜合征型耳聾患者中，GJB2和SLC26A4突變基因的攜帶率比較高，GJB3和mtDNA基因突變的攜帶率較低，加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)非綜合征耳聾患者致病基因突變的分析，了解該地區(qū)耳聾基因的突變譜，可為該地區(qū)乃至全國(guó)耳聾基因型分布提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為耳聾的早期診斷和治療提供參考。