可手術胃癌和結直腸癌中血清TK1和Hepcidin表達及其與臨床病理特征的關系

程 旭 陸 曄 仇慧珠 潘湘濤

細胞質胸苷激酶1(thymidine kinase 1,TK1)與細胞的增殖有關，在DNA的合成中將胸腺嘧啶核苷轉換為單磷酸胸腺嘧啶，是嘧啶補救合成途徑中的關鍵調節酶[1-2]。近期有研究表明腫瘤細胞中高水平的TK1可以從細胞周期中的S期一直持續到M期，TK1的表達水平與DNA的合成具有一致性，在增殖細胞中水平升高[3]，提示TK1的表達水平可以作為腫瘤細胞生長、增殖的1種標志物。我們既往的研究[4]表明Hepcidin是引起腫瘤等疾病中慢性病貧血的主要原因，并且在腫瘤組織中也有表達、并與T分期等有關[5]。因此，本研究應用化學發光法檢測66例可手術的胃腸道腫瘤患者的血清TK1表達情況，同時應用免疫組化方法檢測腫瘤組織中Hepcidin表達，以探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收治本院2016年1月至2017年9月期間手術切除的資料較為完整的66例患者，其中胃癌29例、結直腸癌37例。對其存檔蠟塊，均經病理學檢查復查確診明確無誤，并且術前均未經化療或放療。其中男性40例，女性26例，年齡23～82歲、中位年齡64歲。TNM分期符合全國胃癌協作組病理組規定標準。本組無遠處轉移等晚期腫瘤病例。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化實驗 試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。采用SABC免疫組織化學染色法，所有石蠟標本均進行5 μm切片，連續切4張，置于600烤箱內烤30 min；均分別予二甲苯脫蠟、無水酒精及其他不同濃度酒精脫蠟，自來水洗2 min水化。一張切片進行HE染色復核病理診斷、其余四張SABC染色，按試劑盒的操作規程進行。以PBS代替一抗做陰性對照。結果判斷以細胞質和細胞漿被染成棕黃色或黃褐色為陽性。 高倍鏡下隨機選取5個視野，按照瘤細胞著色的深度計分,染色強度淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。按照陽性細胞數記分,陽性細胞數<10%為0分;11%～25%為1分,26%～50%為2分;51%～75%為3分,75%以上為4分。兩個分值相乘,0分為陰性,記為(-)；1～4分為弱陽性,記為(+);5～8分為中度陽性(++),≥8分為強陽性(+++)。

1.2.2 血清TK1測定 ①TK1試劑盒、GIS-1型化學發光數字成像分析儀均購自華瑞同康生物技術(深圳)有限公司。所有研究工作均在本院腫瘤科實驗室完成。患者空腹抽血5 ml，30 min內高速離心，取血清備用。制備抗體稀釋液、洗液、封閉液。將內含硝酸纖維素膜的膜板平放在一張干凈的濾紙上，不同濃度的標準品按1號、2號、3號的順序點樣到A1、A2、A3位置上，每孔3 μl；待測血清按每孔3 μl順序點后面的膜上，室溫下自然晾干。打開膜板，將膜放入反應盒內，用配置后的稀釋液振搖洗膜2次，每次5 min。棄去洗滌液，加封閉液，室溫下振搖封閉1 h。加一抗(TK1-IgY)，40 ℃下過夜。棄去反應液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加二抗(生物素化抗IgY二抗)，室溫下振搖反應40 min，棄去反應液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加鏈酶親和素-酶復合物，室溫下振搖反應1 h。棄去封閉液，用洗液漂洗3次后，振搖洗滌3次，每次5 min。加ECL發光試劑，過膜浸濕，精確反應1 min。將膜放入CIS-1型化學發光成像分析系統內進行分析。上述重復3次。取3次測量值均數，測量值波動范圍為均數±0.5 mg。②依據既往的大樣本臨床試驗研究數據確定的血清TK1的參考值，即血清TK1水平0～2.0 pmol/l為正常，>2.0 pmol/l為異常[6]。

1.3 統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件，根據資料性質應用卡方檢驗，t檢驗，以及Spearman進行等級相關分析。

2 結果

2.1 胃腸道腫瘤組織中Hepcidin表達情況

Hepcidin在癌旁正常胃黏膜組織中陽性表達率為20.0%(3/15)，胃腸道腫瘤組織中其陽性表達率為62.1%(41/66)，差異具有顯著性(χ2=8.74，P<0.01)。Hepcidin表達與年齡、T分期和脈管浸潤有關(P<0.05，0.01和0.01)，而與性別、有無淋巴結轉移、分化程度、Her-2表達和有無貧血均無相關性(P均>0.05)。具體結果見表1。

2.2 術前血清TK1表達與其臨床病理特點的關系

總陽性表達6例，陽性率9.09%。其中37例腸癌患者TK1陽性3例、陰性34例，而29例胃癌患者TK1陽性3例、陰性26例，兩者之間無統計學意義(χ2=0.10，P>0.05)。考慮到胃癌和腸癌兩者之間TK1的表達無明顯差異，同時鑒于本組資料相對偏少，因此將兩者合并后再進一步進行統計學分析。研究結果表明血清TK1的表達水平與患者性別、分化程度、Her-2表達有關，而與年齡、T分期、脈管浸潤、淋巴結轉移、有無貧血之間均無相關性。胃癌、結直腸癌患者血清TK1表達與其臨床特征的關系見表1。

2.3 Hepcidin表達與血清TK1與Ki-67、Hb水平關系

腫瘤組織中Hepcidin表達與血清TK1與Ki-67、Hb水平的關系見表2。腫瘤組織中Hepcidin表達與Ki-67是相關的，而與Hb水平無相關關系；同樣血清TK1表達與Ki-67相關，而與Hb水平無相關關系。

表1 腫瘤組織中Hepcidin和血清TK1表達與其臨床特征的關系

注:*為P<0.05,**為P<0.01,余均為P>0.05。

表2 腫瘤組織中Hepcidin和血清TK1表達與Ki-67、Hb水平的關系

注:*為P<0.05,**為P<0.01,余均為P>0.05。

將腫瘤組織Hepcidin的表達與血清中TK1表達進行相關分析，結果提示腫瘤組織Hepcidin的表達與血清中TK1表達兩者之間并無直接的相關關系，γ=-0.1005，P>0.05。

3 討論

我們的研究結果表明腫瘤組織中高表達Hepcidin，并且兩者均與患者的年齡、T分期、Ki-67水平和脈管浸潤相關；但與患者的性別、有無淋巴結轉移、分化程度、Her-2表達和有無貧血均無相關關系。這與文獻結果基本一致，如Ward等[7]的研究表明腸癌患者高表達Hepcidin；Kamai等[8]的研究提示腎癌患者腫瘤組織中hepcidin mRNA的表達可能與組織分化及腫瘤的分期無關。Pinnix等[9]的研究則表明乳腺癌患者高表達Hepcidin mRNA。因此，結合本研究結果和文獻結果可以認為在胃腸道腫瘤組織中Hepcidin的表達和腫瘤的局部浸潤有關。上述結果與我們既往的研究結果是一致的[5]。但由于本研究中無遠處轉移等晚期病例，對于該類患者的情況有待于進行進一步深入研究。

近期有研究[10-11]表明食道癌、胃癌、結直腸癌等患者的血清TK1的陽性率明顯高于正常對照組[13]，并且TK1在多種惡性腫瘤中表達上調，預示著預后不良[12]。表明TK1能夠表示腫瘤細胞的增殖程度、因而可以判斷腫瘤的惡性程度，進而可以判斷腫瘤的治療效果和預后。本文TK1陽性率為9.09%(6/66)，低于霍穎等[13]TK1在結腸癌中的陽性率59.21%，我們分析認為本研究中均是能夠可以手術的病例，沒有轉移等Ⅳ期晚期患者，可能影響了TK1的陽性率。同時我們也發現TK1表達與患者的T分期、淋巴結轉移、分化程度等均無相關關系，與劉昕等[14]TK1在胃癌、結腸癌和肺癌等中隨著分期有增高趨勢不相一致，與黃志宇等[12]在晚期非小細胞肺癌中與淋巴結轉移無關的結果一致、但與其TMN分期有關的結果不一致。我們分析產生上述差異的原因是在于選擇的病種及其病情程度(即分期等)有關不完全相同有關，比如劉昕等[14]文章中包含了肺癌等病例，而黃志宇等[12]基本為晚期病例，他們應用的是TMN分期，包括了很多有轉移在內的Ⅳ期患者，而我們的研究中都為能夠手術的病例、無晚期病例，并且我們應用的T分期。當然也不排除我們的病例數不太多也有影響，對于確切的原因，有待于進一步深入研究。另外，TK1的表達與患者的性別、Her-2的表達和Ki-67的水平相關，至今有關這方面的報道尚不多見。目前較多的意見認為Her-2是胃癌的獨立的不良預后因素，雖然在腸癌中的研究略少，但基本的研究結果與在胃癌中的結果是相似的。Ki-67則是1個普遍認為的惡性腫瘤患者的惡性程度及預后的指標，即Ki-67越高則惡性程度越高、預后越差。因此，我們認為本研究中TK1的表達結果與Her-2、Ki-67表達的結果是一致而并不矛盾的的。

我們發現患者腫瘤組織中的Hepcidin表達與血清中的TK1水平不相關(γ=-0.1005，P>0.05)。但是腫瘤組織中的Hepcidin表達與年齡、T分期、脈管浸潤和Ki-67相關，而血清TK1則與性別、Her-2表達，分化程度和Ki-67相關。兩者之間的關系正好是互補關系，提示聯合檢測腫瘤組織中的Hepcidin表達與血清中的TK1的水平，可以更好地判斷患者的病情惡性程度、判斷預后，從而指導臨床更合理地選擇治療方案以取得較好的治療效果。

總之，對于可手術的胃癌和結直腸癌患者聯合檢測腫瘤組織中的Hepcidin表達與血清中的TK1的水平是有一定意義的，值得進一步深入研究、進一步探索。