植物乳桿菌HNU082抗生素抗性與相關基因的關系

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(海南大學食品學院,海南?？?570228)

抗生素(Antibiotics)是一類用于抑制或殺死存在于人和動物體內細菌的天然、半合成或合成化合物[1],使用后暴露于環境中將誘導抗性基因產生和傳播,嚴重威脅生態平衡及人類健康[2-3]?？股乜剐?Antibiotic Resistance)指微生物可耐受抗生素的抑制和致死作用進而存活和繁殖[4],按來源可分為兩種:一是源于抗生素生產菌的先天性抗性,以隨機突變或表達潛在抗性基因等方式使細菌體內基因組上的抗性基因原型、準抗性基因或潛在抗性基因表達而實現[5-6];二是獲得性抗性,由抗生素或抗性基因的接觸和交流所導致。抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)是抗性傳播和發展的媒介,先天性ARGs經后代垂直轉移,獲得性ARGs通過食物鏈水平轉移[7-9]?？剐曰虻乃睫D移是群落中菌株產生多重耐藥性[10]的一個重要原因。

就益生菌而言,抗生素抗性有利有弊。畜禽養殖業常將益生菌作為飼料添加劑與抗生素配伍使用[11],以避免抗生素的某些副作用,提高動物生產性能。Zhang等[12]在肉雞日糧中添加枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),結果表明飼喂Bacillussubtilis的肉雞在第22～35 d,和整個研究期間分別有5.3%和3.3%的體重增加。濫用抗生素導致腸道菌群失調,提高病原菌入侵風險;益生菌調節腸道微生態平衡、促進機體免疫健康[13]。兩者相互作用時,抗生素抗性有助于菌株免于抗生素抑制的不利影響,提高在胃腸道中的存活率,長期定植以發揮預期作用。菌株抗性研究有助于益生菌資源的安全、合理及有效使用?？股卦卺t學領域的廣泛使用引發了對生物安全性的嚴重關切[14],如今抗生素抗性問題也是乳酸菌研究的重要內容。1999年,Netherwood等[15]提出腸道細菌之間可發生抗性基因的水平轉移。Shalini等[16]對乳酸菌抗性的綜述認為,較多的乳酸菌菌株含有抗性基因,包括發酵乳中的乳酸菌,它們在人體腸道中大量存在,直接接觸到腸道微生物群落。因此抗性基因可能水平轉移到腸道內的病原體使得攜帶抗性基因的益生菌成為潛在致病菌,導致抗生素交叉抗性[17]。

Lactobacillusplantarum屬于乳酸桿菌,常見于乳制品、果蔬、肉類及人體腸道中,因優良發酵特性及多種益生作用被廣泛應用于工業生產、食品發酵及醫療保健等領域[18-19]。L.plantarumHNU082分離自我國海南省黎族聚居地自然發酵食品魚茶,其基因組已完全測序(登錄號:PRJCA000348),編碼豐富的碳水化合物活性酶和磷酸轉移酶系統有助于菌株競爭腸道中的營養物質,并且該微生物的生理學和功能方面特性已在體外和體內充分表征,具有益生菌發育的巨大潛力[20]。

本文模擬不同抗生素的環境選擇壓力[21]對菌株存活及生長情況的影響,同時在分子水平上挖掘相關抗性基因數據,分析了抗性基因與抗性程度之間的關系,旨在為益生菌的體外安全評估和合理應用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.plantarumHNU082 分離自海南魚茶;MRS肉湯培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;鹽酸克林霉素、紅霉素、頭孢唑啉鈉、氯霉素、鹽酸土霉素、諾氟沙星、羅紅霉素、鹽酸四環素、利福平、羧芐青霉素鈉、萬古霉素 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、乙酸鈉 分析純,廣州化學試劑廠;甲醇、異丙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、苯酚、氯仿、異戊醇 分析純,西隴科學股份有限公司;含二甲苯菁和溴酚藍雙染料6×DNA loading buffer 北京康為世紀生物科技有限公司;核酸染料(Goldview) 美國AMERCO公司;瓊脂糖 北京天根生化科技有限公司;瓊脂 上海百賽生物技術有限公司;蛋白酶K、SDS、TBE緩沖液、Tris-HCL、CTAB、EDTA 上海吉至生化科技有限公司。

HN-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;85-1恒溫磁力攪拌器 常州澳華儀器有限公司;SW-TFG12通風柜 蘇州蘇凈集團公司;DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠;DP72雙目生物顯微鏡 OLYMPUS;Hettich32R臺式高速冷凍離心機 德國ZENTRIFUGEN;Cell Biosciences凝膠成像分析系統 Alphalmager MN;FA-1604電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司;FST-RO精密型超純水機 普利菲爾應用材料有限公司;BIO-DL移液器 上?？推潓嶒瀮x器設備有限公司;G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司;XH-D漩渦混合器 江蘇康健醫療用品有限公司;LRH-150生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;THZ-100B恒溫培養搖床 上海一恒科學儀器有限公司;UV759紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 將凍存的L.plantarumHNU082菌株接種于MRS液體培養基,37 ℃恒溫靜置培養36 h待培養液明顯渾濁或菌體沉淀后,于-4 ℃保存備用。

1.2.2 DNA提取 采用CTAB法和液氮凍融法[22]提取菌株基因組總DNA。取1 mL菌體培養物于滅菌EP管中,離心(4 ℃,8000 r/min,3 min)棄上清,收集菌體;加入500 μL TE緩沖液(pH8.0),振勻后置液氮中速凍1 min取出,放入65 ℃水浴融化,重復凍融3次;加入80 μL SDS(10%,w/v)和10 μL蛋白酶K(20 mg/mL),37 ℃水浴4 h后取出;加入100 μL NaCl溶液(20 mg/mL)和80 μL CTAB溶液(10 mol/L),混勻后65 ℃水浴20 min,得到DNA粗提取液;加入750 μL苯酚/氯仿/異戊醇溶液(25∶24∶1,v/v),輕輕顛倒搖勻1 min,靜置2 min,重復4次,至無氣泡;離心(4 ℃,12000 r/min,10 min)后取上清至滅菌EP管中;加入500 μL氯仿/異戊醇溶液(24∶1,v/v),混勻1 min,靜置2 min,重復3次;離心(4 ℃,12000 r/min,10 min)后取上清,加入500 μL預冷異丙醇和50 μL乙酸鈉(3 mol/L),混勻,于-20 ℃靜置30 min后離心(4 ℃,12000 r/min,10 min),棄上清得DNA沉淀并用乙醇(70%,v/v)洗滌;烘箱干燥10 min取出,用30 μL TE溶液回溶置于-20 ℃保存。

1.2.3 DNA純度檢測及抗性基因檢測 取DNA提取物與6×DNA loading buffer各2 μL混合,加樣于預先制備的1%瓊脂糖凝膠點樣孔,電壓100 V,0.5×TBE電泳液條件下電泳20 min,電泳后于紫外燈下觀察,對所提DNA的濃度及純度進行檢測后送至上海美吉生物醫藥科技有限公司全基因組測序。根據測序結果統計各基因出現次數,并由此計算基因的出現頻率(抗性基因出現次數/抗性基因出現總數)以及各類抗生素相關抗性基因出現次數占抗性基因出現總數的百分比(某類抗生素相關基因出現次數之和/所有抗性基因出現總數)。

1.2.4 植物乳桿菌抗生素抗性的檢測

1.2.4.1 抗生素配制 根據抗性基因檢測結果,結合抗生素的分類[23]及應用情況,選取各抗生素大類中極具代表性的11種常用抗生素(見1.1)進行篩選?？股噩F配現用,分別稱取各抗生素0.128 g,于3 mL溶劑(表1)中溶解并用MRS液體培養基定容至50 mL,制成2560 μg/mL母液。準確移取4 mL培養基于試管中,121 ℃滅菌后冷卻至室溫。將抗生素母液逐步稀釋,取4 mL培養基與4 mL抗生素母液(2560 μg/mL)混合均勻,制得1280 μg/mL溶液;取4 mL培養基與4 mL濃度為1280 μg/mL的抗生素溶液混合均勻,制得640 μg/mL溶液;同理稀釋為12個濃度梯度:1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL。所有試管溶液體積均為4 mL,每個濃度10支試管。

表1 抗生素配制所用溶劑Table 1 Solvents for antibiotic preparation

1.2.4.2 吸光度檢測 分別取200 μL菌液接種于各含抗生素的培養基及陰性對照管(不含抗生素的培養基)中,震蕩均勻,陰性對照管接種混勻后于-20 ℃凍存,備用,實驗管于37 ℃、120 r/min搖床培養16 h。從培養0 h起,及此后每4 h取出實驗管測定600 nm時吸光度,以溶解震勻的陰性對照管校零。共獲得0、4、8、12、16 h共5個時間點的吸光值,繪制菌體的動態生長曲線。

1.2.4.3 抗生素MIC篩選 根據吸光值的變化所反映菌體的生長情況,選取吸光度值從近似零突增至某值的明顯變化范圍內所含的全部抗生素濃度,作為抗生素抑制濃度驗證值。按上述各濃度梯度抗生素溶液的配制法,制得比驗證濃度高一個梯度的抗生素溶液各5 mL。另有若干含有5 mL瓊脂培養基的25 mL錐形瓶,滅菌備用。將各抗生素溶液分別迅速倒入各錐形瓶中,搖勻后分別迅速倒入培養皿,輕微晃動避免產生氣泡。平板冷卻后,移取100 μLL.plantarumHNU082菌液涂布,于37 ℃厭氧條件下培養48 h。觀察平板菌落生長情況,尋找兩個相鄰驗證值使得較低濃度下有試驗菌生長(PCR檢驗),若其中較高的濃度下無試驗菌生長,則該較高濃度為抗生素MIC。若首次選取的驗證值不符合篩選條件,則據平板結果逐步放大驗證值選取范圍,直到確定出菌株抗生素抗性與敏感性的臨界值。

1.3 數據處理

所有抗生素各時間點下每個濃度2個平行,測定結果以平均值±標準差表示。采用Origin 8.0和Microsoft Excel 2010進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌株抗性基因檢測結果

全基因組測序結果表明,L.plantarumHNU082中存在9類抗生素的抗性基因,共12種(表2)?？剐曰驒z測總頻數為15次,其中lmrD和macB基因分別出現2次和3次,其余基因各出現一次。各基因出現頻率大小有所不同,lmrD和macB分別為13.0%、20.0%,其余基因為6.7%。氟喹諾酮類、林可酰胺類和大環內酯類抗生素相關基因檢測頻數占基因檢測總頻數的比例同為最高,達20.0%,其余均為6.7%。

表2 植物乳桿菌HNU082抗性基因檢測結果Table 2 Resistance gene detection results of L.plantarum HNU082

2.2 菌株的抗生素抗性

2.2.1 抗生素培養菌株生長曲線 菌株在各抗生素培養條件下的生長曲線(圖1),反映菌體的生長狀態和數量變化趨勢,通過觀察在不同濃度抗生素條件下菌株生長情況隨培養時間的變化,可確定菌株耐受與敏感界限,分析其抗性表達情況,從而對抗生素MIC范圍做出初步判斷;當抗生素濃度較高時,菌株數量幾乎不隨時間的增長而增加,即菌株的生長繁殖受到抑制;而抗生素濃度降低至某一濃度時,菌株數量開始呈現出上升趨勢,即在該濃度下表現出抗性。由圖1可見,當鹽酸克林霉素、紅霉素、頭孢唑啉鈉、氯霉素、鹽酸土霉素、羅紅霉素、鹽酸四環素以及羧芐青霉素鈉等8種抗生素的濃度分別降至20、10、5、5、10、10、10、5 μg/mL時菌株展現出良好生長趨勢,隨著培養時間的延長及抗生素濃度降低,菌體數量增長愈加明顯;諾氟沙星和萬古霉素濃度的變化對菌株的生長幾乎不產生影響,1280 μg/mL條件下,隨培養時間的增加試驗菌的數量不斷上升,即最大濃度仍不能抑制菌體生長繁殖,MIC>1280 μg/mL;而利福平的抑制作用顯著,0.625 μg/mL條件下菌株仍無法良好生長,MIC<0.625 μg/mL。

圖1 菌體生長曲線Fig.1 Growth curves of the strain 注:A～K依次表示鹽酸克林霉素、紅霉素、頭孢唑啉鈉、氯霉素、鹽酸土霉素、諾氟沙星、羅紅霉素、鹽酸四環素、利福平、羧芐青霉素鈉、萬古霉素。

2.2.2 抗生素MIC值的確定 根據吸光值曲線選定各抗生素平板驗證濃度范圍(表3),結合驗證結果(圖2、圖3)得到L.plantarumHNU082對11種抗生素的MIC(表4)。鹽酸克林霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環素、羅紅霉素MIC為20 μg/mL,氯霉素、頭孢唑啉鈉、羧芐青霉素鈉、紅霉素MIC為10 μg/mL,諾氟沙星和萬古霉素在1280 μg/mL最大實驗濃度下仍不能抑制試驗菌生長,因此MIC>1280 μg/mL,同理利福平0.625 μg/mL最小濃度下試驗菌仍被抑制,MIC<0.625 μg/mL。在相同的實驗條件下,菌株對不同抗生素表現出不同的抗性特征。結合表1,紅霉素、羅紅霉素同是大環內酯類抗生素,均與macB基因有關,但二者MIC卻不同,即菌株對受相同基因影響的同類抗生素的不同藥物,也表現出不同的抗性程度。MIC范圍內的濃度值越小,則抗生素的抑制作用越明顯,菌株抗生素抗性越弱;相反,MIC值越大表示菌株抗生素抗性越強。

表3 抗生素抑制濃度驗證范圍Table 3 Verification ranges of antibiotic inhibition concentration

圖2 抗生素抑制情況Fig.2 Antibiotic inhibition

圖3 抗生素耐受情況Fig.3 Antibiotic resistance

表4 各抗生素最小抑制濃度Table 4 MIC of antibiotics to L.plantarum HNU082

2.3 抗生素抗性與抗性基因的關系

抗生素MIC值反映菌株的抗生素抗性特征,根據菌株的抗性基因檢測結果,分析抗生素抗性與相應抗性基因的關系:

萬古霉素和諾氟沙星MIC>1280 μg/mL,菌株所表達的抗性最為明顯,萬古霉素相關抗性基因mprF占所檢測基因的6.7%,而諾氟沙星相關抗性基因arlR、emeA、gyrB占所檢測基因的20.0%;此外,lmrC和lmrD與鹽酸克林霉素有關,占所檢測基因的20.0%,但鹽酸克林霉素MIC為20 μg/mL。菌株對上述抗生素均表達出了一定的抗性,基因檢測頻率相同時,抗性特征卻不同,因此抗性程度與相關抗性基因所占比重之間無直接聯系。

在菌株L.plantarumHNU082中,鹽酸四環素和鹽酸土霉素抗性與mepA有關,MIC均為20 μg/mL;頭孢唑啉鈉和羧芐青霉素鈉抗性與pbp1a有關,MIC均為10 μg/mL,而macB是紅霉素和羅紅霉素的相關抗性基因,紅霉素與羅紅霉素MIC分別為10、20 μg/mL,菌株對羅紅霉素的抗性強于紅霉素;因此對于受同一基因影響的不同抗生素,菌株的抗性特征也不相同,抗生素抗性因藥物不同存在差異,抗性基因不是決定抗性特征的絕對因素。

除上述抗生素外,菌株對與fexA相關的氯霉素也具有一定的抗性,而利福平的抑制作用極其明顯,菌株極不耐受,未表達出抗性。通常認為抗性基因的存在與抗生素抗性的表達之間具有一定的聯系,但實驗結果表明,并非所有的抗性基因均會表達出相應的抗性。

3 討論

抗生素抗性表型和抗性基因之間并不存在絕對的相關性。一方面抗生素抗性是基因、移動元件及其細菌宿主之間復雜相互作用的結果,同時伴隨著人類為控制細菌生長而施加的強烈選擇壓力[24],這為本實驗中菌株存在rpoB基因卻未體現出相應抗性提供了合理解釋;另一方面先天性抗性菌株可能具有抗生素抗性表型而不含相應抗性基因[25]。邵玉宇[26]在植物乳桿菌鏈霉素抗性基因的相關研究中提到,植物乳桿菌IMAU60045和IMAU80091均攜帶有aadA和ant(6)基因,但對鏈霉素表現出的耐藥性卻完全不同,該結果與本實驗中的發現一致。通過不斷增加培養基中鏈霉素濃度進行30 d傳代培養,發現IMAU60045的耐藥性增加了1024倍,所以在不同條件下,同一基因相關的抗性特征也會發生變化。某些關于抗性基因與抗生素抗性的相關研究還表明,一種抗性基因不僅是對一種特定藥物產生抗性,還能對其他結構相似藥物存在抗性。不同類的抗生素可能有相同的作用位點,這些位點如果被抗性基因修飾,就會出現交叉抗生素抗性。

有研究[27]報道,乳酸菌菌株的抗生素抗性存在種間特異性而不存在地區特異性,在同一種內,分離自不同地區的菌株的抗生素抗性的差異性較小;宋曉敏等[28]在綜述中對乳酸菌各屬針對不同抗生素的固有耐藥性進行了總結,乳桿菌屬具有抗性的相關抗生素包括肽類萬古霉素、β-內酰胺類頭孢噻、氟喹諾酮類氟哌酸和環丙沙星等,與本實驗植物乳桿菌抗性基因的檢測結果相一致。因此本實驗關于植物乳桿菌抗生素抗性及其相關基因的研究結果,理論上可為其他植物乳桿菌的相關研究給予參考。

本實驗采用試管稀釋法、分光光度法并結合平板驗證的方式對植物乳桿菌進行11種抗生素抗性的篩選,嚴格控制微生物培養條件和吸光度測定時間點,以提高MIC測定結果的準確性和可靠性。但乳酸菌抗生素抗性的測定方法不唯一,許多研究者借鑒致病菌耐藥性測定的標準與方法,如K-B紙片擴散法、打孔法、牛津杯法、肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、E-test法[29-30],其中K-B紙片擴散法、打孔法及牛津杯法以抑菌圈直徑為測定指標,但存在結果不穩定及操作復雜等缺陷,而肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法及E-test法以MIC、MBC為測定指標,具有測定準確重復性好等優點,但工作量大,肉眼難以觀察。目前對乳酸菌耐藥性的研究逐漸受到人們的重視,對耐藥性檢測方法的研究也必不可少,需要調整、改良現有方法或采用多重方法結合,使其更適用于乳酸菌抗性檢測。

4 結論

HNU082在分子水平上存在arlR、emeA、fexA、lmrC、lmrD、macB、mepA、mprF、novA、pbp1a、gyrB、rpoB等抗生素抗性基因;鹽酸克林霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環素、羅紅霉素MIC為20 μg/mL,氯霉素、頭孢唑林鈉、紅霉素、羧芐青霉素鈉MIC為10 μg/mL,諾氟沙星、萬古霉素MIC>1280 μg/mL,利福平MIC<0.625 μg/mL。在相關基因存在的情況下,菌株對鹽酸克林霉素、氯霉素、頭孢唑啉鈉、紅霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環素、羅紅霉素、羧芐青霉素鈉、諾氟沙星以及萬古霉素等抗生素具有抗性,且對萬古霉素和諾氟沙星的抗性最強,但對利福平未表達出相應抗性。菌株抗性程度與抗性基因所占比例大小無關;針對包括受同一基因影響的不同藥物,菌株的抗性特征也各不相同;抗性基因的存在一定程度上反應了菌株表達抗生素抗性的可能性,但抗生素抗性表型與抗性基因之間的關系并不絕對;且抗生素抗性特征不是菌株的固定屬性,表型抗性將會受環境或其他條件的影響發生變化。