低場核磁結合理化指標分析低溫貯藏真空包裝牦牛肉的品質

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(1.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039;2.西華大學西華學院,四川成都 610039)

牦牛是我國青藏高原特有的物種,常年生長在海拔3000米以上的高寒地區,抗寒能力強,體質粗壯結實[1]。牦牛肉富含蛋白質(18%～22%),脂肪含量較低(2%～5%),還含有多種必需氨基酸和微量元素,其氨基酸模式有利于人體消化吸收[2]。我國境內的牦牛大約有1300萬頭,占世界總量的95%以上[3]。雖然我國擁有大量的牦牛資源,但由于地域限制和肉品貯藏手段在各地區發展的不平衡,使得對牦牛肉貯藏技術和貯藏過程中水分變化的相關性研究的報道較少。李儒仁等[4]研究了凍藏對牦牛肉蛋白質、脂質氧化和保水性的影響。馬華麗等[5]研究了引起牦牛肉冷藏過程中變質的原因,分析了感官指標、理化指標和微生物指標在牦牛肉冷藏過程中的變化規律。

真空包裝技術被廣泛用于肉類保鮮,但是,利用真空包裝技術保鮮牦牛肉的應用和研究較少。白風奎等[6]對真空包裝延長牦牛鮮肉貨架期進行研究,通過單因素實驗與正交試驗得出,溫度是影響真空包裝牦牛肉貨架期的主要因素。低場核磁共振技術(Low Field Nuclear Magnetic Resonance,LF-NMR)是近年發展起來的一種快速、有效、無損的水分檢測技術[7]。利用低場核磁共振技術,通過橫向馳豫時間可檢測肉中水分子的移動和分布狀態,馳豫時間越長,表示水與大分子物質之間的作用力越小[8]。國內外許多學者利用低場核磁共振技術研究了雞肉[9]、豬肉[10]、鱈魚肌肉[11]等肉類的T2弛豫時間,可有效地反應水分變化與肉品品質變化之間的關系。

目前,應用低場核磁技術研究真空包裝的牦牛肉品質變化較少。本研究利用低場核磁共振技術監測真空包裝牦牛肉在4 ℃冷藏條件下的水分變化,并將水分及含量變化與肉品品質指標進行Pearson相關性分析,提供一種利用LF-NMR技術對冷藏牦牛肉進行科學、無損的品質監測方法,為肉品品質變化的機理研究及科學合理貯藏牦牛肉提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牦牛肉 當地農貿市場;氧化鎂、三氯乙酸、氯仿、乙二胺四乙酸(EDTA)、碘化鉀、磷酸鹽、硫酸銅、氫氧化鈉等 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;牛血清白蛋白(BSA) BR(生物試劑),上海如吉生物科技發展有限公司;2-硫代巴比妥酸(TBA) 純度≥98.5%,上?？曝S實業有限公司。

MesoMR23-040V-1型低場核磁共振儀 蘇州紐邁分析儀器股份有限公司;K9840型自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;SW-CJ-1FD型無菌工作臺 蘇凈安泰有限公司;Molecular Devices SpectraMax i3x型酶標儀 美谷分子儀器(上海)有限公司;DHP-9052型恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;XINGHE真空包裝機 諸城市興和機械有限公司;DK-98-Ⅱ型水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;TD-5M型離心機 四川蜀科儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛肉預處理 將新鮮牦牛肉剔除筋腱和脂肪,切分為5 cm×5 cm×2 cm,約50 g左右,利用真空包裝袋將牛肉包裝后抽真空放置于4 ℃冰箱中貯藏。在貯藏的第0、3、6、9、12、15、18 d天測定樣品的蛋白質溶解度、揮發性鹽基氮、微生物菌落總數、硫代巴比妥酸值(TBARS)、T2橫向弛豫時間和蒸煮損失。

1.2.2 菌落總數的測定 參考GB4789.2-2016[12]的方法測定菌落總數。

1.2.3 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定 參照GB5009.228-2016[13]的方法,運用自動凱氏定氮儀法測定牦牛肉中TVB-N的含量。

1.2.4 硫代巴比妥酸值的測定 參照Marianne等[14]的方法。與TBA反應的物質的量(TBARS)測量結果以每100 g肉中丙二醛的mg數來表示。

TBARS(mg/100 g)=(A532-A600)/155×(1/10)×72.6×100

式中:A532:532 nm處所測的紫外吸光光度值;A600:600 nm處所測的紫外吸光光度值。

1.2.5 蛋白質溶解度的測定 參照牛力[15]的方法,取1 g樣品切碎,加入pH=7.2的20 mL碘化鉀(1.1 mol/L)和磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L)的混合液,用漩渦震蕩儀震蕩均勻,于4 ℃冰箱中冷藏20 h。然后進行離心,離心力2600×g,時間30 min,室溫。離心后取上清液1 mL,加入雙縮脲試劑A(0.1 g/mL的氫氧化鈉溶液)3 mL,旋渦振蕩后再加入雙縮脲試劑B(0.01 g/mL的硫酸銅溶液)2滴,在37 ℃水浴鍋中加熱20 min。吸取200 μL樣液于96孔板中,用酶標儀測得540 nm波長時肉樣的吸光值。

標準曲線的制作:利用牛血清蛋白作對照,分別取濃度為2 mg/mL的牛血清蛋白0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL(牛血清蛋白質量為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg)。向每只試管中加入蒸餾水至1 mL,加入雙縮脲試劑量和操作方法同上。以牛血清蛋白質濃度作為橫坐標,以吸光度Abs的值為縱坐標繪制標準曲線,得到方程y=0.0366x+0.0002,R2=0.9998。

1.2.6 蒸煮損失的測定 取10 g牦牛肉切成小塊,放于蒸煮袋中,在95 ℃的電熱恒溫水浴鍋內加熱10 min,當肉的中心溫度達到85 ℃時,取出樣品,冷卻至常溫,用濾紙擦干表面水分,然后稱量,以未處理的樣品為對照。蒸煮損失按下式計算:

蒸煮損失(%)=[(蒸煮前肉重-蒸煮后肉重)/蒸煮前肉重]×100

1.2.7 自旋-自旋弛豫時間(T2)的測定 準確稱取樣品3 g,用濾紙擦拭干凈樣品表面水分,置于核磁樣品管中,而后放入磁體腔內,進行核磁共振測定樣品中水分含量,不同貯藏時間的肉樣測定4個平行。首先在Q-FID序列下利用標準水膜進行儀器的校正,采用90°和180°脈沖進行校正,然后放入樣品,尋找樣品的最佳TW、NS參數值,最后選擇Q-CPMG序列進行樣品的弛豫時間采集。測試條件:氫質子共振頻率23 MHz,測定溫度(32±0.02) ℃,選擇Q-CPMG序列,采樣頻率(SW)=100 kHz,回波數(NECH)=3000,回波時間(TE)=1.00 ms,重復次數(NS)=2,等待時間(TW)=3700 ms,90 °脈寬(P1)=10.00 us,180°脈寬(P2)=20.00 us,采樣點數(TD)=150028,O1=940152.75,NMR測得的圖為自由誘導指數衰減曲線,通過儀器自帶的反演軟件進行數據反演,得到樣品中不同組分水分的弛豫時間與峰面積,最后對實驗結果進行分析處理[16]。

1.3 數據處理

試驗數據用SPSS 22.0處理并進行Dunacans差異顯著性分析和Pearson相關性分析,用Origin 8.6進行繪圖處理。

2 結果與分析

2.1 菌落總數的變化

由圖1可見,隨著冷藏時間的延長,牦牛肉中的菌落總數不斷增長。在前6 d微生物生長處于延滯期,因此增長相對比較緩慢,從第9 d開始進入對數期,至第18 d增長迅速,且第15 d已達到7.15lg cfu/g。鮮肉腐敗主要受肉表面微生物的生長和繁殖的影響,微生物的生長和繁殖會引起肉感官品質及理化品質的下降,從而縮短鮮肉的貨架期[17-19]。經過真空包裝的牦牛肉可以有效地隔絕肉與外界環境的接觸,減少氧氣含量,抑制需氧型微生物的生長繁殖,延長肉的貨架期。但是由于牦牛在宰殺后,在分割、儲運及銷售過程中極易受到微生物污染,導致牦牛肉表面的初始微生物數量增加。因此牦牛肉從市場運回實驗室,再經過真空包裝,于4 ℃冷藏條件下貯藏,腐敗在很大程度上取決于肉品初期所帶初始腐敗菌的數量。

圖1 貯藏時間對牦牛肉中菌落總數的影響Fig.1 Effect of storage time on the total number of colonies in vacuum-packaged yak beef

2.2 揮發性鹽基氮(TVB-N)的變化

由圖2可見,牦牛肉中TVB-N的含量隨貯藏時間的延長而增大,這是由貯藏過程中微生物的繁殖和生長分解蛋白質產生氨及胺類物質而引起的,直接影響其新鮮度[20]。TVB-N在第12 d含量達到13.67 mg/100 g,第15 d時已達到21.37 mg/100 g,超過了國家標準GB2707-2016[21]“鮮(凍)畜、禽產品”衛生標準規定(鮮肉的TVB-N≤15 mg/100 g)。

圖2 貯藏時間對牦牛肉中TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of storage time on TVB-N contents in vacuum-packaged yak beef

2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化

由圖3可見,隨著貯藏時間的延長,TBARS值不斷增加,當貯藏到第15 d時,比初始值增加了0.103 mg/100 g。說明隨著貯藏時間的延長,牦牛肉中的脂肪發生氧化酸敗的程度增加。肉中脂肪發生氧化酸敗的原因可能是由于游離脂肪酸在冷藏過程中發生氧化生成醛、酮、酸等小分子物質,因此TBARS值呈增長趨勢[22]。真空包裝的牦牛肉中的脂肪在貯藏期間,受包裝袋內殘留的氧氣、微生物和酶等因素的影響,脂肪會發生氧化反應,從而引起牦牛肉品質的不斷下降。同時肌肉中蛋白質的堿性基團以及碳水化合物中的游離糖類都能夠加快氧化速率[23];除此之外,肌肉中的血紅蛋白和肌紅蛋白的降解產物原卟啉、血紅素同樣具有加快脂肪氧化速率的作用[24]。因此隨著冷藏時間的增長,肉品的氧化程度不斷加深,得到的TBARS值也就相應增大。

圖3 貯藏時間對牦牛肉中TBARS含量的影響Fig.3 Effect of storage time on TBARS contents in vacuum-packaged yak beef

2.4 蛋白質溶解度的變化

蛋白質溶解度的降低是肉品質下降的重要指標,因為肉中蛋白質的加工特性和食用品質只有在蛋白質處于高溶解狀態下才能表現出來。從圖4可以看出,隨著冷藏時間的延長,蛋白質溶解度不斷地減小,當貯藏到第18 d時,比初始值降低了50.92%。這是由于牦牛肉貯藏過程中,蛋白質的水合環境發生變化,破壞了維持蛋白質結構的作用力平衡,并且因為一些基團的水化層被破壞,基團間的相互作用引起蛋白質的聚集或亞基重排,造成蛋白質的變性,溶解度不斷地減小[25-26]。

圖4 貯藏時間對牦牛肉中蛋白質溶解度的影響Fig.4 Effect of storage time on protein solubility in vacuum-packaged yak beef

2.5 蒸煮損失的變化

牦牛肉蒸煮損失的變化如圖5所示,0～3 d牦牛肉蒸煮損失迅速增加,3～12 d出現下降趨勢,12 d以后又出現小幅度上升,推測其原因可能是貯藏前期牦牛肉本身的自由水含量高,這部分水很容易損失。貯藏中期,由于自由水隨著時間的延長不斷滲出,因此蒸煮損出現下降趨勢。到貯藏后期由于微生物的作用和肌肉內各種酶的降解作用,導致蛋白質網狀結構的大量解體,肌肉持水力下降,造成蒸煮損失的再次上升[27]。

圖5 貯藏時間對牦牛肉蒸煮損失的影響Fig.5 Effect of storage time on cooking loss of vacuum-packaged yak beef

2.6 水分及含量的變化

2.6.1 不同貯藏時間橫向弛豫時間T2的變化 圖6顯示的是經過真空包裝的牦牛肉在貯藏過程中的NMR橫向弛豫時間T2的反演圖譜。從圖6中可以看出,肉樣在進行NMR反演后的弛豫圖一共有4個峰,區間分別處于T21、T22(1～10 ms)、T23(10～100 ms)和T24(100～1000 ms)。四個峰的分界明顯,弛豫時間和峰面積各不相同,這可以反映肉中水分存在的三種狀態,其中T21、T22(0～10 ms)表征結合水,與蛋白質等有機大分子緊密結合,作用力強,通常存在于肌纖維內部,即使受肌肉蛋白質結構變化、電荷變化、外力變化的影響,也不能改變其與蛋白質結合的狀態,所以結合水對肌肉系水力影響很小[28]。T23(10～100 ms)表征不易流動水,存在于肌纖絲、肌原纖維及細胞膜之間的不易流動水占肉中水分含量的80%左右,在0 ℃以下結冰,且易受外力、蛋白質結構變化等的影響,通常情況下肌肉的系水力主要由這部分水決定[29]。T24(100～1000 ms)表征的是存在于細胞間隙和結構組織中的自由水。自由水是由物理吸附作用與肉結合,因此這部分水在貯藏過程中很容易流失[30]。由圖6可以看出,隨著貯藏時間的延長,T21、T22弛豫時間后移,但T21、T22峰面積總和減小的幅度較小。弛豫時間的變化說明在貯藏過程中結合水與大分子物質之間作用力的強弱發生改變。T23、T24峰面積不斷減少,說明不易流動水和自由水隨著貯藏時間的延長不斷減少。

圖6 牦牛肉在貯藏過程中橫向弛豫時間分布Fig.6 Transverse relaxation time distribution of yak beef during different storage times

2.6.2 不同貯藏時間牦牛肉水分相對含量的變化 根據T2區間的積分面積可以估算氫質子的相對含量。因此,可以用T21,T22,T23,T24峰積分面積來表示牦牛肉貯藏過程中水分含量的變化情況,即T21,T22,T23,T24質子密度。不同時間貯藏下牦牛肉T2質子密度變化見表1。T21,T22在整個貯藏過程中呈下降趨勢,說明結合水的相對含量隨著貯藏時間的延長有減小的趨勢。T23在整個貯藏過程中不斷減小,在第3 d以后減小幅度增大(p<0.05),這是由于不易流動水不斷地轉變為自由水,從而不斷滲出,因此,T23質子密度顯著下降(p<0.05)。同時可以看出,T24在貯藏過程中不斷減小,到第12 d以后幾乎檢測不到T24的信號。自由水是由物理吸附作用與肉結合,因此這部分水在貯藏過程中很容易流失[16]。

表1 不同貯藏時間牦牛肉T21、T22、T23、T24質子密度變化Table 1 Change of T21,T22,T23,T24density of yak beef at different storage times

2.7 各指標的相關性分析

將真空包裝4 ℃貯藏條件下牦牛肉弛豫特性與品質指標進行相關性分析,結果如表1所示。由表1不同品質指標間的相關性可知,貯藏時間與TVB-N、菌落總數之間呈現極顯著正相關(p<0.01),與TBARS顯著正相關(p<0.05),與蛋白質溶解度、T23、T24極顯著負相關(p<0.01),表明肉的品質指標與貯藏時間之間有著顯著相關性。T21與菌落總數、TVB-N顯著負相關(p<0.05),與蛋白質溶解度顯著正相關(p<0.05);T22與T24顯著正相關(p<0.05)。從相關性分析可以看出T21、T22與其他指標間相關性不大,因為隨著貯藏時間的延長,T21、T22變化不顯著(p>0.05)。菌落總數與T23、T24、蛋白質溶解度呈極顯著負相關(p<0.01),與TVB-N、貯藏時間呈極顯著正相關(p<0.01),與TBARS顯著正相關(p<0.05)。從相關性分析可以看出,肉中的不易流動水和自由水在貯藏過程中都能被微生物利用,隨著微生物的生長繁殖,肉中的蛋白質被分解利用,產生氨及胺類物質從而引起的TVB-N值的增加。TVB-N與TBARS、貯藏時間、菌落總數呈現極顯著正相關性(p<0.01),與蛋白質溶解度、T23之間則呈現極顯著負相關(p<0.01),與T24顯著負相關(p<0.05)。

表2 各指標間的相關性分析Table 2 Correlation analysis between various indicators

TBARS與貯藏時間、菌落總數、TVB-N之間均呈現出顯著或極顯著正相關(p<0.05或p<0.01),與蛋白質溶解度顯著負相關(p<0.05)、與T23極顯著負相關(p<0.01)。蛋白質溶解度與貯藏時間、菌落總數、TVB-N極顯著負相關(p<0.01),與TBARS顯著負相關(p<0.05),與T23、T24極顯著正相關(p<0.01)。在肉的貯藏過程中,氧化反應也在緩慢發生中,研究表明,肉中脂質的氧化與蛋白質的氧化之間可能存在著一定程度的相互作用,包括反應產物之間的相互促進作用[31-32]。隨著氧化過程的推進,形成的自由基與氨基酸側鏈發生羰基化反應,使得蛋白質結構發生變化,從而引起蛋白質溶解度下降[33]。因此在貯藏過程中,脂質氧化產生的活性基團(如氫過氧自由基ROO·,·OO等基團)繼續與體系中的物質產生反應,使得肉的品質降低[34]。

對于水分來說,T23、T24與貯藏時間、TVB-N、TBARS、菌落總數之間顯著負相關(p<0.05),與蛋白質溶解度之間顯著正相關(p<0.05)。T23與貯藏時間、TVB-N、TBARS、蛋白質溶解度、菌落總數、T24之間極顯著相關(p<0.01)。T24與T23、貯藏時間、TVB-N、蛋白質溶解度、菌落總數及蒸煮損失均呈現較好的相關性(p<0.05),這也說明了肉中不易流動水、自由水與肉的持水力、保水性、風味等品質指標相關[35-36]。從相關性分析可以看出牦牛肉在貯藏過程中,物理化學性質的變化常伴隨著肉中水分子流動性的變化[8]。因此可利用T2弛豫時間進行不同貯藏時間下牦牛肉品質的評定。

3 結論

采用真空包裝的牦牛肉,隨著冷藏時間的延長,各品質指標與水分及含量都發生明顯變化,因此貯藏時間的控制對牦牛肉在冷藏過程中品質變化的影響極為重要。利用低場核磁測得橫向弛豫時間T21、T22在貯藏過程中后移,含量減少;T23和T24在整個貯藏期內含量不斷減小,變化顯著(p<0.05)且當第12 d以后自由水大部分流失。通過相關性分析,T23、T24與貯藏時間、TVB-N、TBARS、菌落總數、蛋白質溶解度之間顯著或極顯著相關(p<0.05或p<0.01)。因此,利用低場核磁共振技術對牦牛肉冷藏過程中T2橫向弛豫時間的變化可知,借助水分含量變化可對牦牛肉在貯藏過程中肉品質的變化進行判斷具有一定的可行性。分析水分變化與肉品品質之間的關系,通過橫向弛豫時間T2和質子密度變化可實現對真空包裝牦牛肉貯藏過程中的品質監測。

此外,本次實驗還存在不足之處,實驗過程中沒有測定肉的質構特性與水分變化的關系、自旋-晶格弛豫時間T1的變化、以及水分活度與水分變化之間的關系,后續將繼續深入研究水分變化對牦牛肉脂肪氧化、蛋白質氧化以及質構特性的影響。