藜麥麩皮不同極性部位的抑菌及酪氨酸酶抑制活性研究

,, ,, ,*,,*

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院,“健康山東” 重大社會(huì)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)與治理協(xié)同創(chuàng)新中心,山東濰坊 261053;2.中國(guó)海關(guān)濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東濰坊 261041)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld,Amaranthaceae)是一種在安第斯山區(qū)廣泛種植的一年生雙子葉“假谷物”,屬于藜科,由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而被國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者所廣泛關(guān)注。藜麥中含有大量有益健康的植物化學(xué)物質(zhì),包括皂苷、類黃酮、植物激素、植物甾醇類化合物、酚醛樹脂和生物活性肽[1-2]。皂苷是一類苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的糖苷,其中藜麥皂苷屬于五環(huán)三萜類的齊墩果烷型皂苷,由苷元與一個(gè)或多個(gè)糖基組成[3]。藜麥皂苷按照苷元不同可以分為三類,分別為商陸酸皂苷(Phytolaccagenic acid,PA)、常春藤皂苷(Hederagenin,Hed)、齊墩果酸皂苷(Oleanolic acid,OA)。藜麥皂苷主要分布在藜麥麩皮(即藜麥的外種皮)中[4],皂苷味苦,食用前常通過(guò)水洗或者研磨去除[5],所以藜麥實(shí)際加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的藜麥麩皮。如果可以利用藜麥麩皮,就能提高藜麥的綜合利用價(jià)值。

國(guó)際上對(duì)藜麥的研究方興未艾,然而國(guó)內(nèi)對(duì)藜麥的研究卻起步較晚[6],目前研究主要集中在藜麥引種、栽培、品種選育、種植等領(lǐng)域,個(gè)別研究者對(duì)藜麥中的營(yíng)養(yǎng)成分、礦物元素進(jìn)行了測(cè)定[7-8];功能性成分方面,主要集中在藜麥總黃酮的提取、純化及抗氧化活性研究[9-13];關(guān)于藜麥皂苷的研究多集中在藜麥總皂苷的提取優(yōu)化[14]以及含量的測(cè)定上[15-16]。僅有幾篇關(guān)于藜麥麩皮皂苷的研究,主要為藜麥麩皮的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定[17]、麩皮皂苷的提取優(yōu)化[18]以及抗氧化性[19]上,但對(duì)于藜麥麩皮皂苷的抑菌活性研究較少,藜麥麩皮皂苷對(duì)于酪氨酸酶的抑制活性以及皂苷的裂解規(guī)律尚無(wú)人研究。

針對(duì)以上對(duì)于藜麥麩皮皂苷研究領(lǐng)域的不足,本實(shí)驗(yàn)選擇藜麥麩皮作為研究對(duì)象,旨在研究藜麥麩皮不同萃取部位對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、沙氏腸炎桿菌和銅綠假單胞菌四種致病菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn),探究其抑菌活性,為藜麥麩皮中的活性物質(zhì)在抗菌感染方面的開發(fā)和利用提供參考依據(jù);酪氨酸酶是黑色素形成的關(guān)鍵酶[20],以酪氨酸酶活性的抑制率為考核指標(biāo),觀察抑制效果,為藜麥麩皮中的活性物質(zhì)作為酪氨酸酶的天然抑制劑應(yīng)用于生產(chǎn)中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);利用質(zhì)譜分析皂苷的裂解規(guī)律,可以為以后研究藜麥麩皮皂苷的構(gòu)效關(guān)系奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥麩皮 山西灰藜品種,購(gòu)自山西省靜樂(lè)縣山西億隆藜麥有限公司,粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩子篩選備用;無(wú)水乙醇、石油醚(60～90 ℃沸程)、乙酸乙酯、正丁醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈 色譜級(jí),北京匯海科儀科技有限公司;商陸皂苷甲標(biāo)準(zhǔn)品 純度>99%,上海源葉生物科技有限公司;青霉素 80萬(wàn)單位,山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司;頭孢克肟 抗之霸,100 mg/片,天津華津制藥有限公司;L-Dopa 純度>99%,上海浩然生物公司;酪氨酸酶 ACT=570 U/mg,上海拜朗生物科技有限公司;硅藻土、普通肉湯培養(yǎng)基、瓊脂、直徑5 mm的紙片、96孔板;液相色譜與質(zhì)譜用水為超純水,其余用水為蒸餾水;金黃色葡萄球菌(bio-090809)、表皮葡萄球菌(bio-84876)、沙氏腸炎桿菌(bio-85090)、銅綠假單胞菌(bio-80513) 購(gòu)自廣東省微生物菌種保持中心。

PALL-cascade超純水制備機(jī) 濟(jì)南東岱科學(xué)器材有限公司;YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;BPMJ-150F型霉菌培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;AR224CN電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;U-500可見分光光度計(jì) 上海元析科技有限公司;多功能粉碎機(jī) 廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司;Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津;Agilent-1260安捷倫高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;CT-3質(zhì)構(gòu)儀 倍迎電子科技(上海)有限公司;酶標(biāo)儀 南京貝登醫(yī)療股份有限公司;Omega高速冷凍離心機(jī) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同極性部位的提取 參考Medina-Meza I G等[21]制定提取步驟。稱取藜麥麩皮粉末100 g,加入8倍量體積的75%乙醇提取,超聲震蕩40 min,靜置2 h,紗布過(guò)濾,得上清液1;向剩余的濾渣內(nèi)加入6倍量體積的75%乙醇繼續(xù)提取,超聲震蕩30 min,靜置2 h,抽濾得上清液2。兩次上清液混合,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇;分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取乙醇提取液2～3遍,得到相應(yīng)的萃取層;將萃取層溶液依次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),回收石油醚(60 ℃)、乙酸乙酯(55 ℃)和正丁醇(60 ℃);萃取完后剩余的溶液為水層,將各萃取層放入已恒重的蒸發(fā)皿當(dāng)中,待揮發(fā)至干后稱重,計(jì)算各層得率,得率(%)=(m2-m1)/100×100,其中m1為恒重后蒸發(fā)皿的重量(g),m2為蒸發(fā)皿與萃取層的總重量(g),100為藜麥麩皮的重量(g)。

1.2.2 不同極性部位待測(cè)原液的配制 正丁醇層:取正丁醇層物質(zhì)8.3 mg,溶解于2 mL的甲醇中,濃度為4.15 mg/mL;乙酸乙酯層:取乙酸乙酯層物質(zhì)8.4 mg,溶解于2 mL的甲醇中,濃度為4.2 mg/mL;石油醚層:取石油醚層物質(zhì)8.4 mg,溶解于2 mL的石油醚中,濃度為4.2 mg/mL;水層:取水層物質(zhì)8.3 mg,溶解于2 mL的水中,濃度為4.15 mg/mL。

1.2.3 培養(yǎng)基的配制 取普通肉湯液體培養(yǎng)基,超純水溶解,并不停攪拌,裝入帶棉花塞的三角燒瓶中,121 ℃高壓滅菌15 min,待用。

1.2.4 菌液的配制 將四種細(xì)菌進(jìn)行活化,分別取200 μL的菌液于25 mL的普通肉湯液體培養(yǎng)基中,37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng),觀察并校正菌液濃度,使其相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn),此時(shí)含菌量約為1.5×108CFU/mL,即為受試菌種的菌懸液,稀釋后的菌懸液在15 min內(nèi)接種。

1.2.5 紙片法測(cè)定藜麥麩皮不同萃取物的抑菌活性 依據(jù)參考文獻(xiàn)[22],取24片直徑為5 mm的經(jīng)高壓滅菌后的紙片,分為6組,用鉛筆標(biāo)記1～6,重復(fù)4次;用移液槍準(zhǔn)確移取10 μL的正丁醇層溶液打到1號(hào)紙片上,待其揮干,再次打入10 μL,總共打五次,乙酸乙酯層、石油醚層、水層溶液操作與正丁醇層相同,依次打入2～4號(hào)紙片上;對(duì)照選用1 mg/mL的青霉素與1 mg/mL的頭孢克肟,取10 μL分別打入5、6號(hào)紙片上,對(duì)照組僅打一次;吸取制備好的菌懸液20 μL打入600 mL的生理鹽水中,渦旋振蕩器中充分振蕩搖勻,倒入固體培養(yǎng)基中,使其剛好鋪滿培養(yǎng)基的表面,將紙片有間隔的放入固體培養(yǎng)基中;做好的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中37 ℃進(jìn)行培養(yǎng),6 h后觀察是否有抑菌圈并測(cè)量抑菌圈的大小,記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.6 最低抑菌濃度與最低殺菌濃度的測(cè)定 參考Xue P等[23],利用二倍稀釋法將有抑菌活性的待測(cè)原液依次稀釋,反復(fù)吹打,使其濃度分別為4.15、2.08、1.04、0.52、0.26、0.13 mg/mL,對(duì)照品的濃度依次稀釋為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/mL。取無(wú)菌96孔板,向A1-A6、B1-B6、C1-C6中依次加入稀釋后的待測(cè)原液,A-C為三組平行,D1-D6、E1-E6分別加入青霉素與頭孢克肟的稀釋液作為陽(yáng)性對(duì)照,F1-F3為不加藥物的無(wú)菌液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照,再向各個(gè)孔內(nèi)加入菌液100 μL,此時(shí)藥物濃度變?yōu)樵瓉?lái)的一半。將制作好的96孔板放入37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育12 h后觀察,陰性對(duì)照孔應(yīng)有細(xì)菌生長(zhǎng),否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效,以肉眼未見生長(zhǎng)菌落的最低藥物濃度為待測(cè)溶液對(duì)受試菌種的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC),記錄數(shù)據(jù)。再次孵育12 h后觀察,以不生長(zhǎng)菌落的最低藥物濃度為待測(cè)溶液對(duì)受試菌種的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC),記錄數(shù)據(jù)。

1.2.7 酪氨酸酶的抑制率的測(cè)定 配制濃度依次為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的萃取層溶液與VC對(duì)照液,根據(jù)表1的反應(yīng)體系,在37 ℃水浴鍋中反應(yīng)15 min后,取200 μL反應(yīng)液加入到96孔板中,用酶標(biāo)儀在475 nm下檢測(cè)各萃取層的吸光度。不同濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,三次實(shí)驗(yàn)取平均值,計(jì)算各萃取層對(duì)酪氨酸酶的抑制率[21],抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100。

表1 反應(yīng)體系的組成Table 1 Composition of the reaction system

1.2.8 液質(zhì)聯(lián)用定性分析正丁醇層

1.2.8.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(100 mm×3 mm,1.8 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;流動(dòng)相A:0.1%甲酸水溶液;流動(dòng)相B:甲醇;梯度洗脫[24](流動(dòng)相B濃度):0～5 min,0～5%,5 min～10 min,5%～90%,10 min～15 min,90%～98%,15 min～30 min,98%～5%,流速為0.3 mL/min。

1.2.8.2 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子(ESI+);解離方式:碰撞誘導(dǎo)解離;載氣(N2);鞘氣流速:35 arb;輔助氣流速:10 arb;毛細(xì)管電壓5000 V;毛細(xì)管溫度:320 ℃;電噴霧電壓3500 V;分辨率:50000;離子源溫度:200 ℃。

1.2.9 高效液相色譜法與分光光度法定量分析正丁醇層

1.2.9.1 標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品的配制 準(zhǔn)確稱取1.5 mg商陸皂苷甲標(biāo)準(zhǔn)品與正丁醇層物質(zhì),分別溶解于甲醇中,定容到10 mL的容量瓶中,得到濃度為0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與待測(cè)液。

1.2.9.2 高效液相條件 色譜柱:YMC ODS-Pack(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:A(水),B(乙腈);洗脫條件[25](流動(dòng)相B的濃度):5 min 10%;10 min 15%;15 min 20%;35 min 28%;50 min 40%;60 min 60%;70 min 70%;80 min 70%;90 min 10%;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):202 nm;流速:1 mL/min。

1.2.9.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與樣本含量的測(cè)定 吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,過(guò)0.45 μm微孔濾膜備用,將標(biāo)準(zhǔn)溶液在液相色譜的洗脫條件下進(jìn)行洗脫,進(jìn)樣量分別為5、10、15、20、25 μL記錄數(shù)據(jù),按照色譜圖以皂苷含量為橫坐標(biāo),以峰面積積分值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;將樣品液過(guò)0.45 μm濾膜后按照上述方法進(jìn)樣20 μL,得到峰面積圖,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定皂苷含量。

1.2.9.4 分光光度法分析測(cè)定正丁醇層 移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL的玻璃管當(dāng)中,每組三個(gè)平行,水浴鍋70 ℃下?lián)]發(fā)至干,依次加入0.2 mL的香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL的高氯酸溶液,搖晃均勻后于60 ℃下恒溫水浴15 min,流動(dòng)冷水冷卻5 min,加入5 mL的冰乙酸稀釋,靜置30 min后于可見分光光度計(jì)下560 nm處測(cè)量吸光度值,以含量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;同時(shí)吸取0.5 mL的平行樣品液三份按照上述方法測(cè)量吸光度值,以不加樣品的平行樣作空白,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定含量[15]。

圖1 各極性部位抑菌情況Fig.1 Bacteriostatic effects of polar regions注:a～d依次為Sau,Sep,Se,Pae;分別代表金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌、沙氏腸炎菌、銅綠假單胞菌;1～6號(hào)分別為正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、水萃取物、青霉素與頭孢克肟,下同。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～4次以減小實(shí)驗(yàn)誤差,采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的LSD兩兩比較,以p<0.05表示有差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥麩皮各極性部位得率

由表2可知，四種極性部位的得率依次為7.52%±0.8569%、0.61%±0.0741%、2.28%±0.4370%、11.08%±0.9884%,水層得率最高,其次為正丁醇層,說(shuō)明藜麥麩皮中含有較多的水溶性物質(zhì)例如水溶性的蛋白以及多糖等。

表2 藜麥麩皮各極性部位得率(%)Table 2 The obtain rate of the polarity of the quinoa bran(%)

2.2 藜麥麩皮各極性部位的抑菌效果

與青霉素和頭孢克肟的抑菌圈大小作對(duì)比見表3,正丁醇層物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌[(15.81±0.82) mm]和表皮葡萄球菌[(14.17±1.05) mm]有較大明顯的抑菌圈,對(duì)沙氏腸炎桿菌和銅綠假單胞菌沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn),說(shuō)明此萃取層對(duì)革蘭陽(yáng)性菌較敏感而對(duì)革蘭陰性菌無(wú)明顯效果;乙酸乙酯層物質(zhì)和石油醚層物質(zhì)僅對(duì)金黃色葡萄球菌(10.08±0.26)、(9.92±1.21) mm有一定的抑制作用,對(duì)其余三種菌沒(méi)有抑制作用,說(shuō)明這兩種萃取層可能只對(duì)部分革蘭陽(yáng)性菌有抑制效果;水層物質(zhì)對(duì)四種細(xì)菌都沒(méi)有抑菌作用,說(shuō)明水層內(nèi)沒(méi)有抑菌物質(zhì)的存在;青霉素只對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有抑制效果,所以對(duì)沙氏腸炎和銅綠假單胞菌兩種革蘭陰性菌沒(méi)有抑制效果;頭孢克肟對(duì)部分革蘭陽(yáng)性菌(表皮金黃色葡萄球菌)與部分革蘭陰性菌(沙氏腸炎桿菌)有抑制效果。

表3 抑菌圈直徑的測(cè)定Table 3 Diameter of the antibacterial ring

由于青霉素是一種僅對(duì)革蘭陽(yáng)性菌表現(xiàn)出殺菌效果的廣譜抗生素,所以加入另一種抗生素頭孢克肟來(lái)增強(qiáng)對(duì)照,頭孢克肟屬于三代頭孢類抗生素,對(duì)部分革蘭陰性菌也存在殺菌效果,結(jié)合兩種對(duì)照品,可以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。其余研究顯示,黎藥角花胡頹子[26]、地綿草[27]、綿馬貫眾[28]、米口袋[29]、粗壯女貞[30]的正丁醇萃取層都具有一定的抑菌活性,其中地綿草與綿馬貫眾活性最高的萃取部位為氯仿萃取部位。其最高紙片藥物含量分別為14、5 mg時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為9.6與9.93 mm,均小于本實(shí)驗(yàn)活性最高的正丁醇層(藥物含量為200 μg,抑菌直徑為15.81 mm),正丁醇層具有良好的抑菌活性。

2.3 抑菌圈大小的測(cè)定與比較

對(duì)于方差齊性的檢驗(yàn),p<0.05,表明方差齊性。單因素方差分析顯示數(shù)據(jù)之間比較有差異性,兩兩比較發(fā)現(xiàn),石油醚層與乙酸乙酯層相比較,p>0.05,說(shuō)明兩者之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;正丁醇層與其他三種提取層比較,均p<0.05,說(shuō)明之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且正丁醇層的抑菌效果要優(yōu)于其余萃取層。

2.4 MIC、MBC的測(cè)定結(jié)果

由表4知,活性最高的正丁醇層物質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為1.04 mg/mL,MBC值為2.08 mg/mL;對(duì)表皮葡萄球菌的MIC值為0.52 mg/mL,MBC值為1.04 mg/mL,且對(duì)表皮葡萄球菌的抑制效果要優(yōu)于金黃色葡萄球菌。杜靜婷[31]的研究也發(fā)現(xiàn),正丁醇萃取物在濃度為1 mg/mL的時(shí)候,就可抑制金黃色葡萄球菌的活性,抑制率為11.44%,與測(cè)定的MIC值相同,說(shuō)明在正丁醇層萃取物的濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)便可以抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng),推測(cè)原因可能是因?yàn)檎〈紝虞腿∥镔|(zhì)可以使細(xì)菌的細(xì)胞壁破裂,使細(xì)胞內(nèi)容物分散不均勻而引起的;而徐曉敏[32]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),正丁醇層萃取的物質(zhì)對(duì)于金黃色葡萄球菌較為敏感,其MIC=0.625 mg/mL,與本實(shí)驗(yàn)MIC濃度相差近一倍,分析原因其一可能是由于實(shí)驗(yàn)用的菌種來(lái)源不同導(dǎo)致耐藥強(qiáng)度不相同,其二為萃取層物質(zhì)純度不相同,其三是細(xì)菌的濃度不相同而導(dǎo)致。

表4 金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌的MIC、MBC(mg/mL)Table 4 MIC,MBC of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis(mg/mL)

2.5 藜麥麩皮各提取層對(duì)酪氨酸酶的抑制結(jié)果

藜麥麩皮各提取層對(duì)酪氨酸酶的抑制效果見表5。由表5可知，與陽(yáng)性對(duì)照VC相比較,在濃度為1 mg/mL時(shí),正丁醇層、乙酸乙酯層、石油醚層對(duì)于酪氨酸酶的抑制率分別為55.86%±0.67%、47.81%±1.25%、28.54%±1.53%,但當(dāng)濃度減為0.5 mg/mL時(shí),乙酸乙酯層與石油醚層的抑制率降低為25.24%±2.12%、8.65%±1.64%,利用LSD方差分析對(duì)抑制率進(jìn)行兩兩比較,p值均小于0.05,說(shuō)明不同極性部位對(duì)于酪氨酸酶的抑制率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,正丁醇層物質(zhì)對(duì)于酪氨酸酶的抑制作用最好且相對(duì)穩(wěn)定。而水層對(duì)于酪氨酸酶沒(méi)有抑制作用,原因可能為水層內(nèi)大部分物質(zhì)為粘性多糖,活性物質(zhì)較少。與王建華等[33]的研究相比,在濃度同為1 mg/mL的時(shí)候,正丁醇層物質(zhì)對(duì)于酪氨酸酶的抑制率要大于當(dāng)歸(35.8%)、桔梗(21.6%)、靈芝(9.6%),但比蘆薈(74.2%)的抑制率要低;李俊強(qiáng)等[34]研究發(fā)現(xiàn),在甘草總皂苷濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)于酪氨酸酶的抑制率為50.67%,與正丁醇層1 mg/mL的抑制率大致相同,說(shuō)明正丁醇層物質(zhì)的活性要優(yōu)于甘草皂苷。

表5 各萃取層對(duì)于酪氨酸酶的抑制率(%)Table 5 Inhibitory rate of each extraction layer on tyrosinase

圖2 各萃取層對(duì)酪氨酸酶抑制率Fig.2 Inhibitory rate of each extraction layer on tyrosinase

2.6 LC-MS/MS譜圖

按照文獻(xiàn)裂解規(guī)律[35],以最高峰保留時(shí)間RT(retention time)為7.88分鐘峰為例,如圖7:

圖3 正丁醇層的總離子流譜圖Fig.3 Ion flow chart of n-butanol layer

圖4 正丁醇層7.88分鐘離子碎片圖Fig.4 Ion fragments of n-butanol layer in 7.88 min

圖5 離子碎片的裂解規(guī)律Fig.5 Rule of ion fragmentation

圖6 正丁醇層液相圖Fig.6 N-butanol chromatography

圖7 商陸皂苷甲標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of Esculentoside A

在初始質(zhì)核比m/z=973下,經(jīng)過(guò)一系列的裂解,首先脫掉兩分子葡萄糖(Glucose)與一分子阿拉伯糖(Arabinose),m/z=973→811→649→517,隨后脫掉兩分子的H2O與C=O基團(tuán),m/z=517→499→481→453,最后脫掉一分子的H2O,m/z=453→435。脫掉糖鏈后為商陸酸皂苷的母核結(jié)構(gòu),此裂解方式也與商陸酸皂苷的裂解規(guī)律相吻合,所以可以確定7.88 min峰為商陸酸皂苷的離子峰,以此類推,正丁醇層的物質(zhì)歸類如下:

表6 正丁醇層物質(zhì)歸類Table 6 N-butyl alcohol layer material classification

由此可推斷出正丁醇層的主要活性物質(zhì)為皂苷。

2.7 定量分析皂苷含量

由于齊墩果酸皂苷與常春藤皂苷的標(biāo)準(zhǔn)品較難獲得,所以本實(shí)驗(yàn)采用商陸皂苷甲標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)建立含量測(cè)定方法[15]。

2.7.1 HPLC法測(cè)皂苷含量 根據(jù)液相與質(zhì)譜的比對(duì),47.5與53.7 min的峰為商陸酸皂苷PA,82.5 min的峰為齊墩果酸皂苷OA。商陸皂苷甲液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=227829X-573,R2=0.9978,代入待測(cè)樣品的峰面積得到皂苷含量為1.242 μg,計(jì)算后藜麥麩皮中皂苷純度為61.6%。

2.7.2 分光光度法測(cè)皂苷含量 商陸皂苷甲分光光度法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0053X-0.007,R2=0.9991,表明含量與吸光度值具有良好的線性關(guān)系。測(cè)得正丁醇層皂苷的吸光度平均值為0.159,帶入公式得正丁醇層皂苷含量為31.32 μg,計(jì)算藜麥麩皮正丁醇層皂苷的純度為62.6%。

3 結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)可知,在藜麥麩皮的四種萃取層中,正丁醇層的活性最高,通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜以及離子流譜圖、碎片裂解規(guī)律分析得到正丁醇層所含的主要活性物質(zhì)為藜麥皂苷,液相法與分光光度法定量測(cè)得藜麥皂苷的純度分別為61.6%與62.6%。藜麥皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制作用較為明顯,其抑菌圈直徑分別為(15.81±0.82)與(14.17±1.05) mm;最低抑菌濃度MIC值分別為1.04與0.52 mg/mL,而對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌沒(méi)有表現(xiàn)出抑制活性,說(shuō)明藜麥麩皮皂苷對(duì)革蘭陽(yáng)性菌較為敏感。金黃色葡萄球菌以及表皮葡萄球菌作為臨床上常見的耐藥性致病菌,隨著抗生素的大量濫用,已表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性。所以,將藜麥皂苷進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化后應(yīng)用到臨床治療上也契合當(dāng)今社會(huì)的醫(yī)學(xué)發(fā)展理念,在提高了藜麥麩皮的利用價(jià)值的同時(shí)也為開發(fā)中藥抗菌藥,攻克細(xì)菌耐藥性提供新的思路;對(duì)于酪氨酸酶的抑制,四種萃取層表現(xiàn)出不同的活性,正丁醇萃取層在濃度為1 mg/mL時(shí)對(duì)于酪氨酸酶的抑制率為55.86%±0.67%,效果是同濃度VC對(duì)照品抑制率的58.96%,說(shuō)明藜麥麩皮皂苷對(duì)于酪氨酸酶的抑制效果好且穩(wěn)定,可以作為一種天然的抑制劑應(yīng)用到美白護(hù)膚品中,可以用來(lái)預(yù)防黑色素的沉積和黑色素瘤等,在化妝品領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景。但是由于藜麥麩皮皂苷沒(méi)有進(jìn)行分離純化,高純度的藜麥皂苷是否具有更好的抑菌以及抑制酪氨酸酶的活性效果以及藜麥皂苷的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。