日糧添加BHT對飼喂氧化豆油黃羽肉雞肌肉品質和抗氧化能力的影響

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(南京農業大學動物科技學院,江蘇南京 210095)

豆油不僅能為肉雞提供充足的能量,還能為其提供所需的必需脂肪酸。豆油富含多不飽和脂肪酸,因此極易被家禽消化吸收。但實際生產中,往往會因為油料儲存不當導致油脂氧化,而富含多不飽和脂肪酸的油脂更容易被氧化[1]。在氧化油脂研究中,通常用過氧化值和酸價,丙二醛(MDA)含量三個指標,來檢測一級產物和二級產物的含量,并且以此評價油脂的氧化酸敗程度。其中MDA是氧化酸敗最重要的有毒有害二級產物之一。它能與蛋白質產生交聯作用,改變細胞生理功能,造成細胞損傷[2]。姚仕彬等[3]對草魚腸道黏膜細胞培養試驗發現,1.23～9.89 μmol/L MDA能夠顯著損傷草魚腸道黏膜細胞。林秀秀等[4]研究發現,飼喂大于124 mg/kg MDA會引起草魚肝臟的抗氧化應激。岳洪源[5]研究發現蛋雞在飼養期攝入高度氧化豆油(MDA=342.2 nmol/mL),其雞蛋品質和機體抗氧化狀況均會受到顯著影響。國內外研究發現,在家禽日糧中添加氧化豆油,會導致家禽生產性能下降[2]、肌肉抗氧化性能降低,肉品質變差[6]、貨架期縮短以及不良風味形成,從而損害消費者的健康及利益。研究發現,在日糧中添加抗氧化劑,能夠有效降低甚至消除肉雞肌肉對活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的敏感性[7-8]。

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)是一種極其穩定的人工合成多酚類抗氧化劑。自20世紀50年代以來,BHT因具有穩定食品新鮮程度、營養價值、口味及顏色,防止或者延緩含油食品、肉品的脂質氧化[9]等特點,而被廣泛應用于食品行業。國內外學者在對BHT的體外研究中發現,BHT能夠穩定高效地清除多種自由基[10],Freitas等[11]試驗發現,給Rose308肉雞飼喂含0.02% BHT的日糧42 d,能夠顯著降低胸肌肌肉中硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS),延長貨架期[8]。Ighodaro等[12]研究CCl4誘導的Wistar大鼠軟組織氧化損傷模型時,發現試驗大鼠口服100 mg/kg大鼠體重的BHT 7 d,能夠顯著提高機體的抗氧化能力。Lu等[6]研究發現,在含有氧化油脂日糧中添加100 mg/kg混合人工合成抗氧化劑能夠顯著緩解氧化損傷。關于BHT在優質黃羽肉雞中的應用,以及在氧化豆油影響下,日糧中添加BHT對黃羽肉雞肉品質,肌肉抗氧化性能的影響,國內外鮮有報道。因此,本試驗以優質黃羽肉雞為研究對象,研究氧化豆油影響下,日糧中添加125 mg/kg BHT對黃羽肉雞肉品質以及抗氧化性能的影響并測定相關基因轉錄水平以探究其抗氧化機理。為BHT在黃羽肉雞肉品質以及對肌肉抗氧化方面的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

飼料級BHT 由江蘇邁達新材料股份有限公司提供,純度高于99.9%;黃羽肉雞 240只1日齡,安徽和威農牧有限公司;豆油 江蘇鹽城當地作坊;日糧預混料原料 浙江新維普添加劑有限公司;MDA試劑盒、還原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒、總抗氧化能力(total antioxidative capacity,T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、定量試劑盒 日本TaKaRa生物技術股份有限公司。

I9025型pH計 意大利Hanna Instruments公司;CR-400型色度計 日本柯尼卡美能達集團;HH-4數顯電子恒溫循環水浴鍋 常州國華電器有限公司;C-LM3B數顯式肌肉嫩度儀 北京維欣儀奧科技發展有限公司;ACS(系列)電子秤 永康市永州衡器有限公司;Model PRO 200 double insulated勻漿機 美國ProScience公司;BIO-RAD680酶標儀 美國Bio-Rad公司;ND 2000微量紫外分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司;QuantStudio?5 Real-Time PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 氧化豆油的制備 新鮮壓榨豆油,氧化豆油制備方法參照Ehr等[13]的方法,并加以修改,試驗所需1/5油脂在180 ℃下快速高溫氧化6 h,轉入烘箱與試驗所需剩余油脂充分混合,并在(95±1) ℃條件下加熱14 d。烘箱(95±1) ℃氧化階段,利用增氧設施每隔15 min通入氧氣,增氧設備由自動計時開關控制,通氧速率為4 L/min,氧化結束時與新鮮豆油5∶1(氧化∶新鮮,v/v)混合,即完成制備,所得豆油為試驗用氧化豆油。試驗用氧化豆油與試驗用新鮮豆油均儲存在(10±5) ℃環境中。飼用前一天測定試驗用豆油的過氧化值(方法參見GB 5009.227-2016)、酸價(方法參見GB 5009.229-2016)、MDA含量測定(采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定)。試驗用新鮮豆油:過氧化值POV(2.4 mmol/kg)、酸價(0.8 mg KOH/g)、丙二醛MDA含量(13.4 nmol/mL)。試驗用氧化豆油:過氧化值POV(17.4 mmol/kg)、酸價(6.2 mg KOH/g)、丙二醛MDA含量(376.7 nmol/mL)。

1.2.2 飼料的準備 本試驗選用玉米-豆粕型基礎日糧,參考NRC《家禽營養需要》(1994)標準完成飼料配方設計。配方原料組成以及營養組成詳見表1。

表1 試驗日糧配方及其營養水平Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diets

1.2.3 試驗設計與飼養管理 本試驗采用2×2因子設計,即豆油類型和日糧中BHT的添加濃度。豆油類型根據其品質不同分為新鮮豆油和氧化豆油兩種;結合本實驗室前期預實驗結果,選取日糧中BHT的添加濃度分別為0、125 mg/kg。試驗選用240只1日齡體重接近,健康的黃羽肉雞,隨機分為4組,每組6重復,每個重復10只雞,飼喂四種日糧58 d。試驗采用日糧均為混合粉料,嚴格按照配方配制,機械充分混合后分裝待用。分成以下幾組：新鮮豆油組(F-CON組),飼喂不含BHT的新鮮豆油日糧;新鮮豆油BHT組(F-BHT組),添加125 mg/kg BHT的新鮮豆油日糧;氧化豆油組(O-CON組),飼喂不含BHT的氧化豆油日糧;氧化豆油BHT組(O-BHT組),添加125 mg/kg BHT氧化豆油日糧。本試驗采用立體籠養,自由采食,飲水,保持24 h光照,常規免疫。

1.2.4 樣品采集與處理 試驗第57 d停飼12 h,飲水正常,于第58 d每個重復選取1只接近平均體重的黃羽肉雞,4個處理共選取24只雞,雞頸部靜脈放血宰殺,迅速取出胸肌及腿肌,采胸肌腿肌樣各3 g裝于凍存管中,立即置于-80 ℃用于之后的酶活及轉錄水平的測定。剩余肌肉采取左側胸肌及腿肌于自封袋中并迅速放置在4 ℃冰箱中,用于pH及肉色的測定;右側胸肌及腿肌放入提前標注好的自封袋中,迅速放入-20 ℃冰箱存儲,用于滴水損失、蒸煮損失及剪切力的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 肉色測定 參考Zhang等[14]的試驗方法,宰后24 h立即將剝離的肌肉平放在白色瓷磚上,選靠近骨側肌肉長軸中線,由厚到薄取三點位置,利用色差儀測定并記錄胸肌及腿肌的亮度值(L*)、紅度值(a*)、黃度值(b*)。

1.3.2 pH測定 參考席鵬彬等[15]的測定方法,沿肌肉長軸方向,選取三點,十字刀口,將pH計探針插入開口處0.5～1 cm處,利用pH計測定宰后45 min胸肌及腿肌的pH,于宰后24 h再次測定并記錄樣品pH。

1.3.3 滴水損失 參考Zhang等[16]測定方法并稍作改動,取出胸肌腿肌肉樣,切成3 cm×3 cm×1 cm的條形肉樣,稱初始重,懸掛在保鮮膜包裹的網籃中(保證樣品不與籃壁接觸),放入4 ℃冰箱內存放分別于24和48 h取出再次稱重，滴水損失率計算見式(1)、式(2)。

24 h滴水損失率(%)=[初始重(g)-24 h肉樣重(g)]/初始重(g)×100

式(1)

48 h滴水損失率(%)=[初始重(g)-48 h肉樣重(g)]/初始重(g)×100

式(2)

1.3.4 蒸煮損失 參考Zhang等[16]測定方法,取出存放在4 ℃ 24 h的胸肌腿肌樣品,取15 g左右樣品,放入自封袋中密閉,并置于75 ℃水浴鍋中,加熱至中心溫度達70 ℃,取出冷卻,擦干水分再次稱重，蒸煮損失率計算見式(3)。

蒸煮損失(%)=[蒸煮前肉樣重(g)-蒸煮后肉樣重(g)]/蒸煮前肉樣重(g)×100

式(3)

1.3.5 剪切力 參考Gao等[17]的方法進行測定,將蒸煮后的肉樣沿纖維方向修整成1 cm×1 cm×3 cm的長條塊狀,利用肌肉嫩度儀垂直于肉纖維方向進行切割,讀數并記錄每個肉樣的剪切力,單位為N,每個肉樣剪切3次測定平均值。

1.3.6 抗氧化指標測定 取胸肌和腿肌樣品約0.25 g,按照1∶4 (m/v)加入生理鹽水,在冰水浴條件下利用勻漿機勻漿,勻漿液在4000 r/min條件下離心10 min,取上清液,迅速保存在-20 ℃。主要測定肌肉中MDA和GSH含量,測定肌肉組織中T-SOD活力、GSH-Px活力、CAT活力,以及肌肉的T-AOC。

1.3.7 肌肉組織抗氧化相關基因轉錄水平測定 采用實時定量PCR法測定抗氧化相關基因轉錄相關因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶調節亞單位(γ-modifier subunit of glutamate-cysteine ligase,γ-GCLm)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位(γ-catalytic subunit of glutamate-cysteine ligase,γ-GCLc)、谷胱甘肽過氧化物酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)以及過氧化氫酶(catalase,CAT)在肌肉組織中的表達量。

采用試劑盒提取肌肉中總RNA,利用微量分光光度計,初步檢測提取RNA的濃度及純度的。利用用逆轉錄試劑盒反轉RNA,并將反轉后的cDNA存放在-20 ℃待用。按照TaKaRa公司SYBR Primix Ex Taq TM試劑盒說明書,采用10 μL體系進行qRT-PCR實驗：cDNA 2 μL、SYBR Premix Ex Taq 5μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL、超純水2.4 μL。通過NCBI查找基因序列,利用Primer 3 plus等軟件進行特異性引物的設計,生物公司合成引物。PCR反應程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s(重復40循環);95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。以β-actin作為內參基因,利用2-ΔΔCt法對目的基因mRNA表達進行定義與計算,目的基因引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequences of real-time PCR primers

1.4 數據統計及分析

采用SPSS 22.0中一般線性模型(general liner model,GLM)對實驗數據進行主效應(油脂和BHT水平)及互作效應的差異顯著性檢驗。p值小于0.05時認為差異顯著,當互作效應p值小于0.05時,各處理組采用Turkey法進行多重比較。統計結果以平均值±標準差形式表示。

2 結果與分析

2.1 氧化豆油與BHT對黃羽肉雞肌肉品質的影響

肌肉的pH、肉色、滴水損失、蒸煮損失以及嫩度是常用來評價肉品質的指標。肉色能夠直接影響消費者對產品的選擇。滴水損失和蒸煮損失均能一定程度上影響肉的多汁性、嫩度、色澤以及營養成分的流失。表3、表4數據顯示,與新鮮豆油組相比,氧化豆油組胸肌、腿肌的滴水損失均顯著增加(p<0.05)。有研究發現,氧化油脂中含有大量自由基和醛酮類脂質過氧化物,這些有害物質的大量存在會攻擊細胞膜,造成細胞膜的氧化損傷,最終導致細胞膜通透性發生變化,胞液外流,滴水損失增加,營養價值降低[2]。細胞膜的完整性和滴水損失密切相關,禽類肌肉細胞膜含磷脂量較高,極易被氧化,最終導致肉品質下降[18]。因此,飼喂黃羽肉雞含有氧化豆油的日糧58 d,會使黃羽肉雞胸肌腿肌肌肉的滴水損失顯著增加。此外,腿肌肉色b*顯著降低,其它指標差異不顯著。此結果同樣表明,肉品質穩定性受到了影響,肉色b*的影響最為顯著,這可能與黃羽肉雞品種特性有關,關于氧化油脂對黃羽肉雞肉品質方面影響及其背后的作用機制還有待進一步的研究。

表3 BHT與氧化豆油對黃羽肉雞胸肌肉品質的影響Table 3 Effects of BHT and oxidized oil on breast meat quality of yellow-feathered broilers

由表3、表4數據可知,與不含BHT日糧組相比,含BHT日糧組黃雞胸肌腿肌24 h滴水損失顯著降低(p<0.05),胸肌肌肉蒸煮損失顯著降低(p<0.05),其他指標影響不顯著(p<0.05)。滴水損失可以反映出禽肉在儲存過程中品質的穩定性。雞肉由于其脂肪酸含量和組成特性,易于發生脂質氧化[18]。脂質氧化一般包括三個階段:起始,傳播和終止,一些促氧化物以及活性氧自由基的增多均能開啟脂質氧化,在沒有抗氧化物質存在或體內抗氧化酶活力低下等情況下,脂質氧化反應將持續進行并難以終止[9]。研究表明,BHT能夠在脂質氧化第二階段,通過清除鏈過氧化自由基或抑制新自由基形成的方式,阻止脂質的進一步氧化[9]。近年來研究發現,肉雞日糧中添加抗抗氧化劑,能夠通過提高肌肉組織抗氧化能力,起到穩定肉品質的作用[19-21]。因此,本試驗認為,日糧中抗氧化劑BHT的添加,也能一定程度上通過對肌肉抗氧化狀態的調節,緩解脂質過氧化造成的氧化損傷,改善肌肉肉品質,減少肌肉水分和養分的流失,但其在改善肉品質方面的作用機制還需要更為深入的研究。

表4 BHT與氧化豆油對黃羽肉雞腿肌肉品質的影響Table 4 Effects of BHT and oxidized oil on thigh meat quality of yellow-feathered broilers

2.2 氧化豆油與BHT對黃羽肉雞肌肉MDA含量以及抗氧化能力的影響

表5 BHT與氧化豆油對黃羽肉雞胸肌抗氧化能力的影響Table 5 Effects of BHT and oxidized oil on breast muscle antioxidative status of yellow-feathered broilers

表6 BHT與氧化豆油對黃羽肉雞腿肌抗氧化能力的影響Table 6 Effects of BHT and oxidized oil on thigh muscle antioxidative status of yellow-feathered broilers

GSH作為體內非酶內源性抗氧化物,其水平的變化能夠機體的氧化還原狀態。T-AOC是能夠反映機體總抗氧化能力的另一項重要指標。由表6數據可知,與新鮮豆油組相比,氧化豆油組黃羽肉雞腿肌GSH含量和T-AOC顯著降低(p<0.05)。試驗結果表明,長期飼喂氧化豆油能夠使黃羽肉雞機體氧化還原狀態變差,肌肉抗氧化能力降低。Liang等[27]在研究氧化大豆油對黃羽肉雞腸道氧化應激時,認為T-AOC(評估氧化還原狀態的指標)的下降能夠表明機體內存在自由基產生和消除不平衡的現象,此研究結果與本試驗研究結果基本相似。

由表6油脂與日糧互作結果可知,日糧中BHT的添加能夠顯著緩解由氧化豆油引起的腿肌肌肉內SOD含量的降低(p<0.05)。SOD活力的升高往往會導致H2O2在體內的積聚,CAT能夠清除SOD活性引起的過氧化氫的分解。因此,本試驗認為腿肌CAT活力的顯著升高,可能與SOD活力的增加有一定相關性。Ighodaro等[12]在研究BHT對大鼠肝臟氧化損傷作用時,發現BHT在體內是通過調控CAT活性來抑制脂質過氧化,盡管物種不同,此結果與本試驗結果相似。

綜上所述,本研究認為日糧中添加BHT能夠通過調節CAT活性來降低肌肉中MDA含量,即飼喂BHT有益于抑制脂質進一步氧化,緩解由氧化豆油引發的氧化損傷,提高肌肉組織的抗氧化能力。然而,BHT在肌肉中的抗氧化調控機制還有待進一步研究與討論。

2.3 氧化豆油與BHT對黃羽肉雞肌肉抗氧化相關基因轉錄水平的影響

GSH作為細胞內重要的非酶抗氧化物,其生物合成是在兩個ATP依賴性反應中進行的。谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)是催化其合成的第一速率限制反應,該酶是催化亞基(GCLc)和修飾亞基(GCLm)組成的一個異二聚體[30]。因此,GCL的活性對GSH的合成起重要作用,而GCLc和GCLm在轉錄水平mRNA的表達及翻譯水平蛋白質的表達量能夠在很大程度上決定GCL活性。表7、表8數據顯示,與新鮮豆油組相比,氧化豆油組黃羽肉雞腿肌γ-GCLc mRNA表達量和γ-GCLm mRNA表達量都會顯著降低(p<0.05),對其他指標無顯著影響(p>0.05)。此試驗結果與表6中,受氧化油脂影響,腿肌肌肉GSH含量顯著降低的結果相呼應,共同證明了氧化豆油對黃羽肉雞腿肌肌肉非酶系統的影響,使機體的氧化還原狀態遭到破壞。

表7 BHT與氧化豆油對黃羽肉雞胸肌抗氧化基因表達量的影響Table 7 Effects of BHT and oxidized oil on breast muscle mRNA abundance of genes related to oxidative status of yellow-feathered broilers

表8 BHT與氧化豆油對黃羽肉雞腿肌抗氧化基因表達量的影響Table 8 Effects of BHT and oxidized oil on thigh muscle mRNA abundance of genes related to oxidative status of yellow-feathered broilers

作為基礎亮氨酸拉鏈轉錄因子家庭成員之一[32],Nrf2是細胞氧化應激反應中的關鍵因子,在不同物種間高度保守,并且廣泛存在于機體組織和細胞中。研究表明,在氧化應激條件下Nrf2能夠通過抗氧化劑反應元件介導的幾種二相解毒和抗氧化酶(HO-1、GPX1、SOD1和CAT等)誘導細胞抵抗氧化應激,從而保護組織和細胞免受氧化損傷[32]。由表7、表8互作數據可知,日糧中添加BHT,對由氧化豆油引起的Nrf2 mRNA 表達量下調,有顯著的緩解作用(p<0.05)。試驗結果表明,氧化豆油致使黃羽肉雞肌肉中發生了氧化應激,本試驗中BHT能夠通過Nrf2途徑調節相關酶活,提高肌肉抗氧化。SOD1是T-SOD重要代表性基因之一,肌肉中CAT mRNA表達量的高低與肌肉中CAT酶活力高低密切相關。表7、表8其余抗氧化基因數據結果顯示,與不含有BHT日糧組黃羽肉雞相比,含有BHT日糧組黃羽肉雞肌肉中SOD1和CAT mRNA表達量顯著上調(p<0.05)。

此結果與本試驗表5、表6結果之間相互印證,表明BHT能夠通過調節肌肉抗氧化酶活,提高黃羽肉雞抗氧化能力,緩解氧化油脂帶來的氧化損傷。然而,BHT提高黃羽肉雞肌肉抗氧化能力的具體機制還有待更進一步的研究。

3 結論

本試驗結果表明,氧化豆油能夠導致黃羽肉雞肌肉滴水損失的增加,肌肉MDA含量顯著升高,抗氧化酶活和相關基因mRNA表達量下降。日糧中BHT的添加能夠顯著降低滴水損失,降低MDA含量,提高機體CAT酶活力,上調機體抗氧化基因的mRNA表達。上述結果提示,氧化豆油能夠導致黃羽肉雞肉品質的降低,造成肌肉氧化損傷,致使抗氧化系統的破壞;日糧中125 mg/kg BHT的添加,能夠顯著改善肉品質,通過調節肌肉內抗氧化功能,達到緩解氧化損傷的目的。