全麥粉對體外腸道菌群的影響

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(北京工商大學,食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

小麥是世界上最重要的糧食作物,總產量最高,總貿易量最大,栽培面積和分布面積最廣[1]。全麥粉包含完整的胚芽、胚乳和麩皮,麩皮和胚芽中含有豐富的生物活性化合物,包括B族維生素、礦物質、必需氨基酸、維生素E和植物化學素[2]。而人們經常食用的面粉,即精致小麥則去掉了麩皮和胚芽,僅保留胚乳部分[3]。隨著人們生活水平的改善，精制面粉占據大部分市場,與此同時,各種慢性疾病如肥胖、糖尿病、癌癥等發生的風險也越來越高[4]。全麥粉較精制小麥粉而言,含有較多的營養成分和植物化學素,一方面這些成分保持原生狀態并存在著協同增效作用,另一方面,某些物質不被人體內源性消化酶所水解,直接進入大腸被腸道微生物發酵利用產生代謝產物,維持腸道健康,故增加全谷物的攝入更有利于人體健康。

腸道菌群是一個龐大復雜的生態系統,一個健康成人腸道處居住著500～1000種細菌,總數達1013～1014,是人體體細胞的10倍之多,它們編碼的基因是人體自身基因的100倍,大量研究表明腸道菌群組成的結構和比例與人體健康狀況存在著密切的聯系[5]。全麥粉相比于精制小麥粉,外層的麩皮富含纖維、抗性淀粉和低聚糖,內層胚芽含有維生素、礦物質、多酚等有益物質,這些物質的存在可能會降低血糖指數或血糖負荷,改善糖代謝,并減少超重和肥胖的發生[6]。研究表明全谷物中的膳食纖維易吸水膨脹,可增加人體飽腹感,有利于減少食物的攝入,具有減少腸道間有毒物質殘留,預防痔瘡、便秘、調節腸道微環境等功效[7]。

本文選用山東小麥,用分層碾米機磨去外層麩皮得到小麥籽粒,全麥粉由麩皮與籽粒經研磨得到,精制小麥粉由小麥籽粒研磨得到,依次進行體外模擬消化和發酵實驗,實驗設置陰性(NC)及陽性(PC)對照,陰性對照不添加小麥粉,陽性對照選擇低聚果糖。通過比對全麥粉與精制小麥粉成分區別、以及不同組腸道菌群結構變化與代謝產物的區別,研究了全麥粉和精制小麥粉對腸道菌群調節的影響,旨在通過腸道菌群的視角呼吁大眾多食用全谷物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥 山東沂蒙山新小麥,由中國農業科學院農產品加工研究所提供;α-淀粉酶(1 kU/g)、胃蛋白酶(8 kU/g)、胰液素 美國sigma公司;豬膽鹽、低聚果糖、透析袋(1000 Da) 上海源葉生物有限公司;胰蛋白胨酵母浸粉 北京奧博星生物技術有限公司;無水氯化鈣、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純,西隴化工股份有限公司;七水硫酸鎂、樹脂天青、維生素K1、氯化血紅素 分析純,麥克林公司;L-半胱氨酸、吐溫80 國藥集團化學試劑有限公司;β-葡聚糖試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司;DNA提取試劑盒 美國Omega公司;DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

AL203電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;YXQ-LS-50A高壓滅菌鍋 上海云泰儀器儀表有限公司;TM05C-C分層碾米機 佐竹機械(蘇州)有限公司;FDV氣引粉碎機 日本佑崎有限公司;DG250小型厭氧工作站 英國Don Whitley Scientific公司;920 Titrando恒定pH電位滴定儀 美國奧豪斯(上海)有限公司;Free-zoneRR實驗室凍干機 美國LABCONCO公司;C-MAG HS 7磁力攪拌器 德國IKA公司;AOC-20i氣相色譜(配有氫火焰離子檢測器) 日本島津公司;NanoDrop2000紫外分光光度計 美國賽默飛公司;LX-07A研磨機 紅光工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 精制小麥粉的制備及前處理 參照Gong等[8]方法,全谷小麥用分層碾米機磨去占總質量20%的外層麩皮后,剩下的籽粒即為精制小麥谷物。全谷小麥和精制小麥用氣引式粉碎機粉碎,并過80目篩,分別得到全麥粉(whole wheat,WW)和精制小麥粉(refined wheat,RW)。

1.2.2 谷物粉基本成分及部分活性成分的測定 水分含量測定參照:GB5009.3-2010;灰分含量測定參照:GB5009.4-2010;脂肪含量測定參照:GB/T 5009.6-2003;蛋白質含量測定參照:GB5009.5-2010;膳食纖維含量的測定參照:GB/T 5009.88-2014;β-葡聚糖含量的測定方法參照試劑盒中AACC Method 32-23.01方法進行測定;多酚含量測定參照龔凌霄[9]的方法。

1.2.3 培養基的配制 胰蛋白胨2 g/L、酵母浸粉2 g/L、氯化鈉0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.04 g/L、碳酸鈉2 g/L、七水硫酸鎂0.01 g/L、無水氯化鈣0.01 g/L、吐溫80 2 mL/L、氯化血紅素50 mg/L、維生素K110 μL/L、L-半胱氨酸0.5 g/L、豬膽鹽0.5 g/L、樹脂天青1 mg/L。配成溶液后,用1 mol/L 鹽酸調節基礎培養基的pH=6.8,經高壓滅菌后轉移到厭氧工作站除氧24 h。

1.2.4 發酵菌液的采集與制備 選取自愿者3人,要求身體健康,沒有胃腸病史,近半年來沒有接受過抗生素的治療。于實驗當天采集3位志愿者的糞便各30 g左右,置于厭氧箱中,采集過程10 min內完成。用10倍量(w/v)的磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)稀釋采集的糞便,混勻后靜置用四層紗布濾去殘渣即為發酵菌液。

1.2.5 體外模擬胃腸道消化和發酵過程 參照曹文燕等[10]方法,取WW與RW各12 g,分別加入100 mL去離子水在121 ℃條件下滅菌15 min冷卻后再加入100 mL無菌蒸餾水,得全麥粉與精制小麥粉懸濁液;于懸濁液中加入7 mL(20 U/mL)α-淀粉酶溶液,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養30 min以模擬口腔消化;用6 mol/L鹽酸調節pH=2,加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸(含0.54 g胃蛋白酶),37 ℃恒溫水浴振蕩器培養2 h,模擬胃消化;用6 mol/L氫氧化鈉調節pH=6.8,并加入25 mL 0.5 mol/L碳酸氫鈉(含0.11 g胰液素和0.7 g豬膽鹽),放入1000 Da的再生纖維素透析袋中,在0.1 mol/L氯化鈉溶液,37 ℃過夜透析,第2 d更換一次透析液,再透析2 h,模擬小腸消化;將透析袋中的消化乳糜低溫真空冷凍干燥得消化糜粉。取消化糜粉0.5 g,與45 mL培養基(按照1.2.3制備)、5 mL發酵菌液(按照1.2.4制備)充分混勻后在37 ℃厭氧條件下發酵48 h,模擬大腸消化;分別于24和48 h取部分發酵液用于菌群多樣性和短鏈脂肪酸分析。實驗設置陰性及陽性對照,其中,陰性對照即以0.5 g純凈水代替消化糜(NC),陽性對照即0.5 g低聚果糖代替消化糜(PC)。

1.2.6 新一代16S rRNA測序技術對菌群多樣性分析 參照試劑盒Stool DNA kits提取發酵液中總的DNA,用紫外分光光度計于260 nm測定OD值,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進行檢測。擴增細菌的16S區域V4區,擴增引物515F(5′ GTGCCAGC MGCCGCGGTAA 3′)和806R(5′ GGACTACHVGGG TWTCTAAT 3′),在引物的5′端加上合適的Hiseq2500 PE250測序的index序列和接頭序列,完成特異性引物的設計。以稀釋后的基因組DNA為模板,使用KAPA HiFiHotstart ReadyMix PCR kit高保真酶進行PCR[11],確保擴增的準確性和高效性。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物。切膠回收后,用紫外分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳進行文庫質檢。質檢合格后,使用Illumina Hiseq PE250進行上機測序。測序結束后,按照相似度97%進行聚類,得到OTU(Operational Taxonomic Units),每個OTU被認為可以代表一個物種。

1.2.7 氣相色譜(GC)測定發酵液中短鏈脂肪酸(SCFA)含量

1.2.7.1 樣品前處理 取發酵24、48 h的2 mL發酵液,加0.2 mL 50% H2SO4酸化10 min,再加2 mL乙醚在冰上間歇震蕩提取30 min,后于4800 r/min離心10 min,取上清液進樣[12]。

1.2.7.2 色譜條件色譜柱 SH-Rtx-5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);以氮氣作為載氣,總流速為140 mL/min;進樣量1 μL,進樣口溫度280 ℃,FID檢測器溫度300 ℃,不分流;采用程序升溫:80 ℃;3 ℃/min,150 ℃;20 ℃/min,250 ℃,2 min[13]。

1.2.8 相關性分析 利用Pearson對發酵液中SCFA與腸道菌群的變化量相關性進行分析。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 基本成分分析

從表1可知,全麥粉(WW)中膳食纖維含量顯著高于精制小麥粉RW(p<0.05),達12.45%,與趙吉凱等[14]研究一致,碾磨脫去小麥籽粒總質量20%的外層麩皮(主要含有纖維素、半纖維素和木質素),RW中總膳食纖維降低了33.1%。WW中總酚含量顯著高于RW(p<0.05),達2765.50 μg GAE/g,與向莉[15]對黑小麥多酚含量的測定相近。除此之外,WW中蛋白質、脂肪含量也顯著高于RW(p<0.05)。研究表明,WW較RW在成分組成上,膳食纖維和多酚等可被微生物發酵利用的成分含量顯著增加(p<0.05),分別為精制小麥粉的1.49倍和1.45倍。

表1 基本成分Table 1 Component of samples

2.2 小麥粉對體外發酵腸道微生物的α-多樣性的影響

從圖1可知,隨著測序深度的延長,曲線趨于平緩,這表明本實驗測序深度挖掘的信息量足夠本實驗分析[16]。用Observed species指數、Chao1指數、ACE指數、Shannon指數來評價微生物α-多樣性,從表2可知,與陽性和陰性對照組相比,WW和RW微生物多樣性下降,WW下降更多,產生這種結果可能是由于WW和RW中復雜的化學組成在體外進行發酵后,打破了原有體系中微生物之間的平衡,刺激了某些微生物的生長,導致微生物-微生物之間產生競爭作用,降低了微生物多樣性。杜亞軍[17]研究了7種水溶性膳食纖維發現顯著促進了雙歧桿菌或嗜酸乳桿菌的生長,而嗜酸乳桿菌或雙歧桿菌的增殖對大腸桿菌的生長產生了抑制作用。這表明某些微生物的生長會改變另一些微生物的生長情況,與本文的研究結果一致。而隨著發酵時間的延長,由于營養物質有限,微生物多樣性呈現下降趨勢。

圖1 Shannon稀釋曲線圖Fig.1 Shannon rareation curve

表2 α-多樣性指數Table 2 Index of α-diversity

如圖2所示,發酵24 h后,各組間共有OTU 103個,隨著發酵時間的延長到48 h時,各組間共有OTU減少到74個。與陰性和陽性對照組相比,WW和RW發酵24 h后,特有OTU較少,分別為1和2個OUT,發酵48 h后特有OUT則減少為0和1個,這同樣也表明了WW和RW發酵后微生物多樣性降低。

圖2 不同發酵時間Veen圖Fig.2 Veen diagram of different fermentation times

2.3 小麥粉對體外發酵腸道微生物物種組成的影響

圖3A和圖3B分別是物種在門和屬的水平上進行的物種組成分析。變形菌門(Proteobacteria)為革蘭氏陰性菌,包含大多數致病菌,如大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)等[18],與添加發酵基質組相比,圖3A所示,陰性對照組(不添加發酵基質)中變形菌門相對豐度較高,高達13%～20%;WW組在體外發酵變形菌門相對豐度最低,比陰性對照組大約降低了5倍,這表明小麥中某一成分在體外發酵時抑制了變形菌門的生長繁殖。與陽性對照組相比,添加小麥發酵后在門的水平上發生了明顯的變化,擬桿菌門(Bacteroidetes)降低,厚壁菌門(Firmicutes)升高,可能是谷物中成分刺激了厚壁菌門生長,厚壁菌門大量增殖占用了發酵液中的營養和空間,從而抑制了擬桿菌門的生長。

圖3 相對豐度柱狀圖Fig.3 Relative abundance histogram注:A:在門的水平上;B:在屬的水平上。

低聚果糖被公認為是一種益生元,低聚果糖能夠刺激益生菌雙歧桿菌(Bifidobacterium)[19]和乳酸桿菌(Lactobacillus)的生長,同時在體外能夠維持普斯菌屬(Prevotella)的生長[20]。與陰性對照組相比,添加小麥谷物發酵,降低了艾克曼菌屬(Akkermansia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、噬膽菌屬(Bilophila)、布勞特氏菌屬(Blautia)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、埃希式菌屬(Escherichia)、梭菌屬(Dorea)毛螺菌屬(Lachnospira)、顫螺菌屬(Oscillospira)、副桿菌屬(Parabacteroides)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminoccus)的相對豐度,Jensen等[21]研究發現梭菌屬(Dorea)、埃希式菌屬、顫螺菌屬和瘤胃球菌屬可能會增加炎癥發生的風險;升高了氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、小類桿菌屬(Dialister)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、巨單胞菌屬(Megamonas)、和巨型球菌屬(Megasphaera)相對豐度。與RW相比,WW發酵升高了氨基酸球菌屬、雙歧桿菌屬、噬膽菌屬、巨單胞菌屬、巨型球菌屬的相對豐度,且雙歧桿菌屬相對豐度是RW發酵的1.19倍,表明WW較RW更易刺激益生菌-雙歧桿菌的增殖;降低了脫硫弧菌屬、小類桿菌屬、埃希式菌屬(Faecalibacterium)、普斯菌屬和薩特式菌屬(Sutterella)的相對豐度,且埃希氏菌屬相對豐度降低了52%。以上結果表明,體外添加小麥基質發酵后,會調節腸道微生物物種組成的變化,與RW相比,WW更易刺激雙歧桿菌生長,抑制致病菌埃希氏菌的增殖。

2.4 短鏈脂肪酸(SCFA)含量的測定

SCFA主要是飲食中不被內源性消化酶所消化的乳糜物質進入大腸后被微生物利用發酵產生的代謝產物,是2～4碳組成的脂肪酸,在大腸處乙酸大約為60%,丙酸為25%,丁酸為15%,大部分的乙酸參與系統循環達到周邊組織,丙酸主要被肝臟利用,然而大部分的丁酸作為結腸上皮細胞的能量物質被利用[22-23]。乙酸、丙酸與丁酸在腸道中的含量最高,是腸道中主要的短鏈脂肪酸[24]。此實驗只對這三種短鏈脂肪酸做相應檢測。由表3可得,與發酵48 h的陰性對照組相比,WW、RW發酵48 h后乙酸、丙酸、丁酸的含量均顯著增加(p<0.05),且發酵48 h后WW中的乙酸含量與陽性對照組接近。本實驗結果發現,發酵過程中WW和RW內的丙酸在短鏈脂肪酸中含量最高,這可能與接種源個體差異有關,De等[25]分別用10個不同的個體糞便發酵小麥麩皮,結果發現乙酸、丙酸和丁酸的比例和個人差異性有關。在物種組成分析(圖3B)時,WW組和RW組在體外發酵后巨單胞菌屬(Megamonas)和巨行球菌屬(Megasphaera)豐度較高,達60%,Megamonas和Megasphaera是產丙酸鹽的細菌[26],因此丙酸含量較高。

表3 發酵液中短鏈脂肪酸含量(mmol/L)Table 3 Short-chain fatty acid contents of fermentation broth(mmol/L)

2.5 短鏈脂肪酸(SCFA)與腸道菌群分布的相關性分析

經Pearson相關分析可以得知,短鏈脂肪酸中(乙酸、丙酸、丁酸)與腸道菌群的變化量存在相關性，如表4。其中,雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、小類桿菌屬(Dialister)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)、克雷菌屬(Klebsiella)、巨單細胞菌屬(Megamonas)、薩特氏菌屬(Sutterella)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、巨球型菌(Megasphaera)與乙酸、丙酸、丁酸存在顯著正相關。說明這些菌屬會促進短鏈脂肪酸的生成,如雙歧桿菌屬等有益菌會在腸道中分解消化糜中的碳水化合物以及蛋白質等物質產生短鏈脂肪酸,短鏈脂肪酸不但可以為上皮細胞提供能量來源,同時可以降低腸道pH,抑制炎癥的發生,這就在代謝產物的角度驗證了益生菌的益生作用所在。但艾克曼菌屬(Akkermansia)、擬桿菌屬(Bacteroides)、噬膽菌屬(Bilophila)、布勞特氏菌屬(Blautia)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、梭菌屬(Dorea)、埃希式菌屬(Escherichia)、副桿菌屬(Parabacteroides)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和瘤胃球菌屬(Ruminoccus)、顫螺菌屬(Oscillospira)等則與短鏈脂肪酸呈負相關,這說明短鏈脂肪酸抑制了抑制致病菌埃希氏菌屬等致病菌的增殖。Pan等[27]研究表明益生菌(雙歧桿菌屬)的生長與SCFA的生產有關,與實驗結果一致。

表4 發酵液中SCFA與腸道菌群分布之間的相關性系數分析表Table 4 Analysis table of correlation coefficient between SCFA in fermentation broth and intestinal flora distribution

3 討論與結論

本實驗研究了全麥粉(WW)和精制小麥粉(RW)在體外對腸道菌群的調節作用,結果表明,WW較RW在成分組成上,膳食纖維和多酚等可被微生物發酵利用的成分含量顯著增加。體外添加小麥基質發酵降低了腸道微生物多樣性,其中擬桿菌門相對豐度下降,厚壁菌門相對豐度升高,但明顯增加了短鏈脂肪酸的含量并調節了腸道菌群的物種組成。被腸道微生物發酵利用后產生WW比RW更多的短鏈脂肪酸,而短鏈脂肪酸又與雙歧桿菌屬、小類桿菌屬等一些益生菌有正相關作用,因此高含量的膳食纖維、多酚、短鏈脂肪酸與腸道菌群的豐度與多樣性有密切的交互作用。此外,與RW相比,WW升高了發酵液中氨基酸球菌屬、雙歧桿菌屬、噬膽菌屬、巨單胞菌屬、巨型球菌屬等的相對豐度,且益生菌雙歧桿菌屬相對豐度是精制小麥粉發酵的1.19倍;降低了脫硫弧菌屬、小類桿菌屬、埃希式菌屬、普斯菌屬和薩特式菌屬等的相對豐度,且致病菌-埃希氏菌屬相對豐度降低了52%。由于全麥粉(WW)較精制小麥粉(RW)具有更好的調節腸道菌群、保護腸道健康的作用,因此在面粉加工處理上如果較多地保留外層麩皮中可被腸道微生物利用的益生元成分,即可以提升小麥粉的健康價值。