實時熒光PCR法鑒別瑪咖及其摻假物蕪菁

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(中國檢驗檢疫科學研究院農產品安全研究中心,北京 100176)

瑪咖(LepidiummeyeniiWalp)是十字花科獨行菜屬植物,藥食兩用,原產于南美洲秘魯,現已在我國云南、四川、西藏、新疆等地大面積引種[1]。瑪咖富含生物堿、芥子油苷、甾醇、脂肪酸、多酚、瑪咖酞胺和瑪咖烯等多種生物活性物質[2-4],作為重要的保健品和新資源食品原料,雖然當前產量不斷攀升,但仍具有價格優勢。由于蕪菁(BrassicarapaL.)外形與瑪咖極為相似,受經濟利益驅使,不法商家將蕪菁冒充瑪咖,制成瑪咖粉、瑪咖片、瑪咖飲品等謀取暴利,這給瑪咖健康產業有序發展帶來了嚴重負面影響。

目前鑒別瑪咖真偽的主要技術包括顯微鏡法[5]、紅外光譜[6-7]、氣/液相色譜[8]、電子鼻[9]、普通PCR(Polymerase Chain Reaction)[10]、RPA(Recombinase Polymerase Amplification)[11]、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)[12]、DNA條形碼[13]以及NMR(Nuclear Magnetic Resonance)[14]等。如通過對比瑪咖與蕪菁橫切面和粉末顆粒的顯微特征可鑒別兩種植物[5],利用近紅外光譜[6-7]、電子鼻[9]等技術結合化學計量學,構建模式識別模型可實現瑪咖產地與等級的判別,以及采用氣質聯用質譜[4],分析瑪咖揮發性組分的種類和數量差異來判定瑪咖的產地和質量等。實時熒光PCR方法現已成為肉類[15-16]、谷物[17-18]、乳制品[19]等食品原料及制品中動植物成分種類鑒定的首選,部分檢測方法已經標準化推廣應用。防御素(defensin)是一類廣泛存在于生物界的內源性抗菌肽。有文獻利用瑪咖defensin基因設計了可特異鑒定瑪咖成分的普通PCR引物[10]。本研究根據defensin基因序列,分別設計了瑪咖及摻假物蕪菁特異引物探針,建立了瑪咖原料及制品中瑪咖與蕪菁兩種植物成分的實時熒光PCR檢測方法,為鑒別瑪咖真實屬性提供了新的技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑪咖(L.meyeniiWalp)樣品 13份,產地分別為云南(3份)、西藏(3份)、四川(3份)、新疆(3份)及秘魯(1份);蕪菁(B.rapa)樣品 3份,收集自山東、河南及新疆(詳見表1)，上述樣品均經云南省農業科學院藥用植物研究所李晚誼研究員生態學鑒定為瑪咖和蕪菁;馬鈴薯、紅薯、木薯、山藥、葛根、獨行菜、油菜、芥菜、甘藍、白菜、蘿卜、胡蘿卜、人參、花生、大米、玉米及黃豆等原料樣品 均購于北京超市;人參瑪咖片、瑪咖壓片糖果、瑪咖粉、瑪咖晶華固體飲料、瑪咖人參固體飲料、黑瑪咖干片及瑪咖片等加工制品(編號S1～S7) 均購于北京商城(見表1);TaqMan?預混合液(4369016) 美國ABI公司;植物基因組DNA提取試劑盒(DP305) 天根生化科技(北京)有限公司。

表1 試驗樣品信息Table 1 The experimental samples information

BS電子天平 德國Sartorius公司;M20研磨機 德國IKA公司;7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物與探針設計 植物通用引物探針引自文獻[18],瑪咖、蕪菁特異引物探針是根據兩種植物的defensin基因序列自行設計(表2),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 引物探針序列Table 2 The sequence of primers and probes

1.2.2 樣品DNA提取 所有樣品均采用天根生化科技(北京)有限公司植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)進行DNA提取,具體操作步驟按照說明書進行。

1.2.3 實時熒光PCR反應 反應體系:TaqMan?預混合液12.5 μL;上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL;探針(10 μmol/L)0.5 μL;DNA模板5 μL,用無菌水補至總體系為25 μL。

擴增程序:95 ℃預變性10 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 60 s,共運行45個循環。

1.2.4 方法特異性分析 采用瑪咖、蕪菁特異引物探針分別實時熒光PCR擴增13份瑪咖、3份蕪菁以及同為十字花科的獨行菜、油菜、芥菜、甘藍、白菜、蘿卜和其它科屬的馬鈴薯、紅薯、木薯、山藥、葛根、胡蘿卜、人參、花生、大米、玉米及黃豆等33份樣品DNA,以確證方法的特異性,擴增程序按照1.2.3,每個樣品重復擴增3次。

1.2.5 方法靈敏度分析

1.2.5.1 絕對靈敏度 將已測定濃度的云南產瑪咖(編號:YN1)及新疆產蕪菁(編號:XJWJ)DNA,用無菌水稀釋至濃度為100 ng/μL,各取10 μL濃度為100 ng/μL的DNA至90 μL無菌水中,得到濃度為10 ng/μL的DNA,由此依次10倍梯度稀釋至1、0.1及0.01 ng/μL,按照1.2.3進行實時熒光PCR擴增,分析方法的絕對靈敏度,每個樣品重復擴增3次。

1.2.5.2 相對靈敏度 取云南產瑪咖(編號:YN1)及新疆產蕪菁(編號:XJWJ)各100 g干燥塊莖樣品,分別用研磨機粉粹成60目粉末狀。取10 g瑪咖粉加入到10 g蕪菁粉中,充分混合均勻,保證樣品在蕪菁粉中均勻散布,制成含有50%(w/w)瑪咖成分的樣品;取4 g含有50%(w/w)瑪咖成分的樣品加入到16 g蕪菁粉中,充分混勻制成含有10%(w/w)瑪咖成分的樣品;取10 g含有10%(w/w)瑪咖成分的樣品加入到10 g蕪菁粉中,充分混勻制成含有5%(w/w)瑪咖成分的樣品;取4 g含有5%(w/w)瑪咖成分的樣品加入到16 g蕪菁粉中,充分混勻制成含有1%(w/w)瑪咖成分的樣品;取2 g含有1%(w/w)瑪咖成分的樣品加入到18 g蕪菁粉中,充分混勻制成含有0.1%(w/w)瑪咖成分的樣品;按照此方法再依次制成瑪咖粉中含有50%、10%、5%、1%及0.1%(w/w)蕪菁成分的樣品。取不同重量比的瑪咖粉和蕪菁粉樣品,DNA提取后按照1.2.3進行實時熒光PCR擴增,分析方法的相對靈敏度,每個樣品重復擴增3次。

1.2.6 方法適用性驗證 為判定已建立方法是否適用瑪咖制品中瑪咖與蕪菁成分的鑒別,研究中選取瑪咖干片、糖果壓片、干粉以及固體飲料等4類7份市售瑪咖常見加工品(見表1,編號:S-1～S-7)進行測試,每個樣品取樣2份,提取DNA后先擴增18S rRNA基因以確保樣品DNA提取的有效性,以避免假陰性結果發生;然后擴增瑪咖和蕪菁的defensin基因以判斷樣品中是否含有兩種植物成分,每個樣品重復擴增3次。

1.2.7 檢測結果判定 樣品經植物通用引物探針實時熒光PCR擴增時,出現明顯的熒光擴增曲線,Ct值<45.0,視為樣品DNA提取有效;否則DNA提取無效,應重新提取DNA,直至Ct值<45.0[20]。而經瑪咖、蕪菁引物探針擴增時,樣品如出現明顯的熒光擴增曲線,Ct值<40.0,則判定樣品含有瑪咖或蕪菁植物源性成分;如Ct值≥45.0,則判定為不含瑪咖或蕪菁植物源性成分;如40.0

2 結果與分析

2.1 方法特異性

從NCBI數據庫下載瑪咖(GenBank.AY829229.1)和同屬十字花科的蕪菁(GenBank.AY383485.1)、油菜(GenBank.KC967208.1)、芥菜(GenBank.DQ191752.1)以及禾本科的玉米(GenBank.AJ849917.1)defensin基因序列,利用Clustal Omega在線軟件進行比對,在序列差異區分別設計了瑪咖與蕪菁實時熒光PCR特異引物及探針(圖1)。

圖1 瑪咖、蕪菁、油菜、芥菜以及玉米defensin基因序列比對結果Fig.1 Alignment results of defensin gene sequence among maca,rappini,rape,mustard,and corn注:方框無灰色底紋標記序列為瑪咖上、下游引物,方框有灰色底紋標記序列為瑪咖探針;下劃線無灰色底紋標記序列為蕪菁上、下游引物,下劃線有灰色底紋標記序列為蕪菁探針。

采用植物通用引物探針擴增瑪咖、蕪菁、馬鈴薯、紅薯、木薯、山藥、葛根、獨行菜、油菜、芥菜、甘藍、白菜、蘿卜、胡蘿卜、人參、花生、大米、玉米及黃豆等33份樣品DNA的18S rRNA基因,Ct值在(19.32±0.03)～(30.47±0.29)(表3),表明33份樣品均提取到質量較好的DNA;采用瑪咖引物探針對上述樣品進行擴增的結果顯示:13份瑪咖樣品均得到擴增,Ct值在(27.10±0.14)～(31.06±0.18),其它樣品和空白對照(無菌水)無擴增,Ct值均為45.0(表3);經蕪菁引物探針擴增,所有樣品中3份蕪菁和白菜樣品產生典型熒光擴增曲線,Ct值在(29.78±0.17)～(32.35±0.11),其它樣品及空白對照(無菌水)無熒光擴增信號,Ct值均為45.0(表3)。本實驗結果表明,所設計的瑪咖引物探針具有很好的特異性,能夠有效擴增瑪咖成分,且與其它植物均無交叉反應;蕪菁引物探針雖與白菜有交叉反應,但與瑪咖無交叉反應。

表3 瑪咖與蕪菁引物探針特異性分析結果Table 3 The result of specific amplification by primers and probes of both maca and rappini

續表

2.2 方法靈敏度

2.2.1 絕對靈敏度 將濃度為100、10、1、0.1及0.01 ng/μL的云南產瑪咖(編號:YN1)及新疆產蕪菁(編號:XJWJ)DNA樣品分別進行實時熒光PCR擴增(圖2),結果表明,當瑪咖和蕪菁DNA濃度在0.01 ng/μL及以上時均得到熒光擴增,空白對照(無菌水)無擴增,說明方法檢測瑪咖及蕪菁的濃度低限均可達0.01 ng/μL。

圖2 實時熒光PCR方法絕對靈敏度檢測結果Fig.2 The absolute sensitivity of real-time PCR注:A:瑪咖;B:蕪菁；圖3同。

2.2.2 相對靈敏度 采用實時熒光PCR擴增質量比分別為50%、10%、5%、1%及0.1%(w/w)的云南產瑪咖(編號:YN1)及新疆產蕪菁(編號:XJWJ)粉末DNA。結果表明:當瑪咖粉和蕪菁粉含量在0.1%(w/w)及以上時,均有典型熒光擴增曲線,空白對照(無菌水)無擴增,說明方法檢測瑪咖和蕪菁的相對靈敏度均為0.1%(w/w)(圖3)。

圖3 實時熒光PCR方法相對靈敏度檢測結果Fig.3 The relative sensitivity of real-time PCR methods

2.3 對市售樣品的檢測

提取人參瑪咖片、瑪咖壓片糖果、瑪咖粉、瑪咖晶華固體飲料、瑪咖人參固體飲料、黑瑪咖干片及瑪咖片(編號:S-1～S-7)等7份制品DNA(樣品信息見表1),經植物通用引物探針擴增,均有典型的熒光擴增曲線,說明所有制品提取到質量合格的DNA(圖4);采用設計的瑪咖檢測引物探針擴增上述制品,7份標稱含有瑪咖成分的制品DNA均有顯著的熒光增幅,說明7份制品中均含有標識的瑪咖成分(圖5A);經蕪菁檢測引物探針擴增發現,人參瑪咖片(S-1)和瑪咖粉(S-3)DNA也有熒光增幅(圖5B),而其它5份制品未出現熒光增幅,說明S-1和S-3兩份樣品中檢出了未標識的蕪菁成分。上述結果表明,本研究所建立的實時熒光PCR法可用于市售瑪咖制品中瑪咖與蕪菁源性成分的鑒定。

圖4 市售瑪咖制品DNA提取質量實時熒光PCR檢測結果Fig.4 Detection results of commercial maca products DNA quality by real-time PCR methods

圖5 市售制品中瑪咖與蕪菁成分實時熒光PCR檢測結果Fig.5 Detection results of both maca and rappini in commercial products by real-time PCR methods注:A:瑪咖;B:蕪菁。

3 討論與結論

近年來,基于DNA的現代分子生物學技術克服了傳統檢測方法受環境、氣候、加工方式等因素影響的局限性,已廣泛應用在食品真偽鑒別領域。前期有文獻基于普通PCR方法[10]和RPA方法[11]應用于瑪咖、蕪菁成分的檢測。劉冬虹等[10]根據瑪咖defensin基因序列設計了瑪咖特異性引物,建立了瑪咖及其制品中瑪咖源性成分普通PCR檢測方法,絕對靈敏度達0.1 ng/μL,相對靈敏度達0.1%以上,PCR擴增產物片段長度為173 bp;同時,根據蕪菁H蛋白基因序列,設計了特異性檢測蕪菁源性成分的PCR引物,擴增產物片段長度為147 bp。該方法只需要設計特異性引物,檢測成本低,適合基層實驗室應用。郭燕華等[11]采用RPA技術,根據瑪咖defensin序列設計了瑪咖特異性引物,建立了瑪咖及其制品中瑪咖源性成分RPA檢測方法,檢測靈敏度也達0.1 ng/μL,擴增產物片段長度為186 bp。此方法可在室溫環境下完成擴增反應,檢測速度更快,該研究中未提及摻假物蕪菁源性成分的RPA檢測方法。上述兩種方法操作簡單、成本低,但均需要瓊脂糖凝膠電泳和EB染色,相對費時費力。比較而言,本研究建立的實時熒光PCR方法更靈敏,并且無需電泳、染色步驟,避免了電泳過程中易污染問題,更適于標準化推廣應用。由于瑪咖制品為深加工產品,受加工過程中的機械外力、化學因素的影響,其DNA完整性較差,因此,本研究在建立瑪咖、蕪菁成分實時熒光PCR檢測方法過程中,在保證靶標基因片段特異性的前提下,盡可能縮短了檢測基因擴增長度,其中瑪咖擴增片段長度為119 bp,蕪菁為115 bp,兩者均短于上述普通PCR法和RPA法,更利于精深加工品中瑪咖、蕪菁物種成分的鑒定。本研究中瑪咖和蕪菁的特異性引物探針均是根據defensin基因序列設計的,由于根部膨大的蕪菁由白菜馴化而成,因此兩者基因同源性極高,導致蕪菁的特異性引物探針與白菜也有交叉反應。但目前瑪咖的摻假主要是以蕪菁替代瑪咖而非白菜,因此蕪菁與白菜的交叉反應仍能滿足瑪咖摻假的鑒別。

本研究針對蕪菁冒充瑪咖問題,根據defensin基因分別設計了瑪咖、蕪菁特異引物探針,建立了瑪咖及其制品中兩種植物成分的實時熒光PCR鑒別方法。經驗證,該方法特異性好,靈敏度高,其絕對靈敏度達0.01 ng/μL,相對靈敏度達0.1%(w/w),并能準確應用于市售制品中瑪咖與蕪菁源性成分的檢測。上述方法仍為定性檢測方法,隨著微滴數字PCR技術在轉基因產品含量[21]以及肉制品[22]、米制品[23]等物種定量鑒別中的成功應用,后續擬開展瑪咖及其摻假物蕪菁的精準定量檢測方法研究,以期為瑪咖及其制品的真偽鑒別提供更有力的技術支撐。