雙歧桿菌復合微膠囊的工藝優化、表征及功能特性分析

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(廣州醫科大學公共衛生學院,廣東廣州 511436)

雙歧桿菌是人體腸道中的益生菌,其制品的益生作用比單純服用雙歧因子制劑效果更好[1],但活菌數需超過106CFU/g或106CFU/mL才能有效地發揮作用。然而,雙歧桿菌對氧、酸性環境極為敏感,保持活性較困難[2]。此外,胃液中較低的pH和氧化還原電位、小腸中的高濃度膽汁溶液都會使其活性大幅度降低[3]。微膠囊技術是一種能保持益生菌存活率的方法,可提高益生菌在加工、儲藏及通過人體消化道期間對氧、胃酸和膽汁的耐受性[4]。微膠囊壁材的選擇對于微膠囊產品的性能起決定性作用,在制備益生菌微膠囊過程中使用單一壁材,難以達到微膠囊化的所有要求。研究表明使用復合壁材包埋雙歧桿菌可增加其存活率,在微膠囊制備過程中具有特定優勢。因此,深入研究復合微膠囊對益生菌的保護作用十分必要。

已有研究證實,以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材,制備出的雙歧桿菌微膠囊，在胃酸耐受性和穩定性上較游離的菌液均有所提高[5]。也有學者采用羧甲基殼聚糖和海藻酸鹽為壁材，制備長雙歧桿菌BIOMA5920微膠囊,結果顯示,用復合壁材比用單一壁材制備的微膠囊在包埋率、腸溶性等方面更好[6]。這些研究表明復合壁材用于益生菌微膠囊的制備,具有包埋率高,腸溶性好,穩定性高,耐受性強等特點。但現有復合壁材制備的微膠囊仍存在定向釋放困難、菌體成活率低、粒徑均一性較差等不足[7],亟需探索具有提高活菌率、定向釋放特性、良好均一性的新型復合壁材。膳食纖維根據溶解性的不同可分為水不溶性膳食纖維和水溶性膳食纖維。水不溶性膳食纖維的主要成分是纖維素、半纖維素、木質素,在胃中不能被消化吸收,而在腸道里面可被菌群降解利用,可作為益生菌的微膠囊壁材,有望實現益生菌在腸道的定向釋放[8-9]。此外,膳食纖維中的多糖成分可充當益生菌的營養物質,起到培養基的作用,提高活菌率。因此,水不溶性膳食纖維作為益生菌微膠囊的壁材具有獨特的優勢。但單獨使用水不溶性膳食纖維凝膠性能較差,結合海藻酸鈉和卡拉膠作為微膠囊的壁材,可增加其包埋率和腸溶性。

針對上述問題,本文擬采用香蕉皮水不溶性膳食纖維-海藻酸鈉-卡拉膠為復合壁材包埋雙歧桿菌BB12,同時在芯材中添加低聚果糖作為益生元,進一步提高益生菌的存活率。此外,本研究還將優化微膠囊化工藝,并對該微膠囊的結構表征和在消化道環境中的穩定性進行了研究,以期最大限度地保持菌體的生物活性,為工業化生產活菌制劑提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物雙歧桿菌BB12(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBB-12) 丹麥科漢森公司;香蕉 廣州南沙;海藻酸鈉(Sodium alginate) 河南優元生物科技有限公司;卡拉膠(Carrageenan) 滕州市香凝生物工程有限公司;低聚果糖(Fructo oligosaccharides) 山東欣鼎生物科技有限公司;CaCl2廣州化學試劑;NaCl 廣州化學試劑廠;PBS粉劑 廣州杰特偉生物科技有限公司;膽鹽 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;胃蛋白酶(10000 U/g)、胰蛋白酶(250 U/g) 美國Sigma公司;MRS肉湯、MRS瓊脂 廣東環凱生物科技有限公司。

FD-1A-80真空冷凍干燥機 北京博醫實驗儀器有限公司;D2F-6050電熱烘干箱 上海一恒科學儀器有限公司;SPX-250B生化培養箱 上海銳豐儀器儀表有限公司;ZHJH-C1106B生物潔凈工作臺 上海智域分析儀器制造有限公司;ME204E電子分析天平 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;mLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 日本SANYO公司;Allegra x-22R離心機 美國BECKMAN COULTER公司;F30400209磁力攪拌器 意大利VELP SCIENTIFICA公司;FE20/EL20pH計 梅特勒托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香蕉皮中水不溶性膳食纖維的制備 參考張豐等[10]的方法進行制備。將香蕉皮真空冷凍干燥后,使用粉碎機粉碎并過篩(40目)。稱取香蕉皮干粉放入帶蓋的瓶子中,加入12%的NaOH溶液,料液比為2∶50 g/mL。將瓶子放入超聲清洗儀中超聲30 min后,放入61 ℃的水浴鍋中水浴90 min。取出后,在瓶中滴加鹽酸(5 mol/L)調pH至7.0左右。將瓶中液體倒入離心管中,離心管放入離心機(5000 r/min,6 min),室溫下進行離心處理。倒掉濾液,在濾渣中加入2～3倍體積的無水乙醇脫色3 h后,抽濾,用生理鹽水沖洗3次,取出濾渣,放置在錫紙內,放入電熱鼓風干燥箱中干燥(50 ℃,4～5 h),直至恒重,即得香蕉皮水不溶性膳食纖維。

1.2.2 雙歧桿菌微膠囊的制備

1.2.2.1 菌種活化 將121 ℃滅菌15 min后的MRS液體培養基冷卻,然后在培養基中按0.1%(v/v)接種保存于-20 ℃下的雙歧桿菌BB12,37 ℃恒溫培養24～36 h,進行活化。

1.2.2.2 菌懸液制備 將已活化至第三代的雙歧桿菌菌液在4 ℃下離心(4000 r/min,10 min)后,除去上清液,收集菌泥,再加入與培養液等體積(30 mL)的生理鹽水混合均勻后備用。同時,進行梯度稀釋,按平板計數法檢測菌懸液的活菌數,活菌數用CFU/mL表示。

1.2.2.3 復合微膠囊的制備 稱取一定質量的海藻酸鈉和卡拉膠,加入5 mL pH6.5的無菌PBS緩沖液,置于75～85 ℃水浴溶解。然后加入一定質量的香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液,備用。將一定濃度的低聚果糖溶液和雙歧桿菌菌懸液以1∶1 (v/v)的比例混合,此為芯材溶液。取制備好的芯材溶液5 mL,加入等體積的壁材溶液,混合均勻。用10 mL注射器將混合液噴射到60 mL 5% CaCl2溶液中,用磁力攪拌器攪拌一定時間,形成膠囊,過濾,并用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。將濕膠囊置于-80 ℃冷凍干燥24～48 h,可制得凍干微膠囊。

1.2.3 微膠囊包埋產率的測定 取1 g濕膠囊,加入9 mL pH為7.4的解囊液[PBS 緩沖液(pH7.4)][11]中,37 ℃振蕩完全崩解后,用無菌生理鹽水進行梯度稀釋,稀釋至10-3,使活菌數在30～300 CFU/mL范圍內。取0.1 mL稀釋過的菌懸液滴于MRS固體培養基上,用涂布器涂布均勻,密封,編號,倒置,在37 ℃恒溫條件下培養48～72 h,觀察菌落生長情況并計數[12]。

包埋產率(%)=G1×V1×M/(N0×V0×M0)×100

式中:G1:1 mL解囊液中的雙歧桿菌活菌數(CFU/mL);V1:解囊液的總體積(mL);N0:包埋前單位體積原菌液中的活菌數(CFU/mL);V0:制備微膠囊所用原菌液的體積(mL);M:所得微膠囊的總重量(g);M0:稱取微膠囊的重量(g)。

1.2.4 單因素實驗 以包埋產率為指標,分別研究香蕉皮水不溶性膳食纖維含量、海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度、低聚果糖濃度及攪拌時間對雙歧桿菌BB12微膠囊包埋效果的影響。

1.2.4.1 香蕉皮水不溶性膳食纖維含量 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無菌PBS緩沖液,然后分別加入不同質量的香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,所得混合液中海藻酸鈉和卡拉膠的濃度為2%和3%,水不溶性膳食纖維的含量分別為0、15%、30%、45%、60%,紫外燈照射30 min,制成壁材溶液。將雙歧桿菌菌懸液和濃度為5%的低聚果糖溶液以1∶1 (v/v)的比例混合,制成芯材溶液。將制備好的芯材溶液5 mL,加入等體積的壁材溶液,混合均勻。用10 mL注射器將混合液噴射到60 mL 5% CaCl2溶液中,用磁力攪拌器攪拌30 min,形成膠囊,并過濾,用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。

1.2.4.2 海藻酸鈉濃度 稱取卡拉膠和海藻酸鈉,溶于5 mL pH6.5的無菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中卡拉膠濃度為3%,水不溶性膳食纖維含量15%,海藻酸鈉的含量分別為2%、3%、4%、5%、6%。其余步驟同1.2.4.1。

1.2.4.3 卡拉膠濃度 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中卡拉膠濃度分別為2%、3%、4%、5%、6%,水不溶性膳食纖維含量15%,海藻酸鈉的含量為2%。其余步驟同1.2.4.1。

1.2.4.4 低聚果糖濃度 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中海藻酸鈉和卡拉膠的濃度為2%和3%,水不溶性膳食纖維含量15%。將濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的低聚果糖溶液和雙歧桿菌菌懸液以1∶1 (v/v)的比例混合,此為芯材溶液。其余步驟同1.2.4.1。

1.2.4.5 攪拌時間 稱取海藻酸鈉和卡拉膠,溶于5 mL pH6.5的無菌PBS緩沖液,然后加入香蕉皮水不溶性膳食纖維,攪拌均勻,紫外燈照射30 min,此為壁材溶液。所得混合液中海藻酸鈉和卡拉膠的濃度為2%和3%,水不溶性膳食纖維含量15%。將雙歧桿菌菌懸液和濃度為5%的低聚果糖溶液以1∶1 (v/v)的比例混合,制成芯材溶液。取制備好的芯材溶液5 mL,加入等體積的壁材溶液,混合均勻。用10 mL注射器將混合液噴射到60 mL 5% CaCl2溶液中,然后用磁力攪拌器分別攪拌10、20、30、40、50 min,形成膠囊,過濾,并用蒸餾水將膠囊沖洗3次,即得濕膠囊。

1.2.5 最陡爬坡實驗 最陡爬坡試驗以實驗值變化梯度為爬坡方向。根據前期實驗得到的各單因素效應值的大小確定變化步長及變化方向,使響應值快速逼近最大響應區域。

1.2.6 響應面優化實驗設計 根據Box-Behnken中心組合設計原理,采用5 因素3水平的響應面分析法,以包埋產率為響應值,設計響應面組合,對雙歧桿菌BB12微膠囊的制備工藝進行優化。實驗設計如表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 微膠囊的表征分析

1.2.7.1 紅外光譜 稱取最優條件下制備的凍干微膠囊、芯材、壁材單一成分及其混合物各約1 g,分別與100 mg KBr混合,在研缽中充分研磨后,壓片,置于4000～400 cm-1內進行紅外光譜掃描(分辨率為4 cm-1)。

1.2.7.2 掃描電鏡 用導電膠將最優條件下制備的樣品粉末黏在SEM載物臺上,樣品表面噴金,30 min后將載物臺置于SEM掃描電鏡中進行掃描(加速電壓為20 kV,電流為75 mA)。

1.2.8 雙歧桿菌微膠囊的功能特性

1.2.8.1 耐胃酸實驗 配制人工模擬胃液[13]:取16.4 mL鹽酸(5 mol/L)于燒杯中,加入約800 mL蒸餾水稀釋,加入10 g胃蛋白酶,攪勻后加水定容至1000 mL。參照馮超[14]的方法進行實驗。取最優條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g和1.2.2.2得到的未包埋的雙歧桿菌原菌液1 mL,分別置于9 mL人工模擬胃液中,37 ℃恒溫搖晃0、1、2 h后,棄去胃液。收集濕微膠囊,用解囊液徹底崩解后,制成菌懸液,計數。

1.2.8.2 耐膽鹽實驗 將濃度為0%、0.3%、0.4%、0.5%的膽酸鈉溶液,121 ℃滅菌。參照肖仔君等[15]的方法進行實驗。取最優條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g和1.2.2.2得到的未包埋的雙歧桿菌原菌液1 mL,分別置于9 mL上述溶液,37 ℃水浴3 h后,棄去膽汁。收集微膠囊,用解囊液徹底崩解后,制成菌懸液,計數。

1.2.8.3 腸道釋放性 配制人工模擬腸液[13]:取6.8 g磷酸二氫鉀加500 mL蒸餾水溶解后,用0.4%的氫氧化鈉溶液調節pH至6.8;另取10 g胰蛋白酶加適量水使之溶解,將兩液混合后,加水定容至1000 mL即得。參照郝瑩等[16]的方法進行實驗。稱取最優條件下得到的雙歧桿菌微膠囊1 g,置于9 mL人工模擬腸液中,放在恒溫搖床中進行處理,將恒溫搖床的溫度調節為37 ℃,搖速設置成210 r/min,0、20、40、60 min后,直接吸取3～4 mL溶液,測定其在波長600 nm處的透光率。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 香蕉皮水不溶性膳食纖維含量對微膠囊包埋產率的影響 由圖1可知,未添加香蕉皮水不溶性膳食纖維的微膠囊包埋產率較低。而添加香蕉皮水不溶性膳食纖維的包埋產率升高，當膳食纖維含量為45%時包埋產率達到最大值,為66.46%。香蕉皮水不溶性膳食纖維含量過低時,微膠囊的囊壁厚度不均勻,穩定性較差,使得微膠囊容易破裂,芯材易滲漏在固化液中。當香蕉皮水不溶性膳食纖維含量超過45%并繼續增加時,壁材流動性變差,不利于形成均一穩定的雙歧桿菌微膠囊。為優化實驗,香蕉皮水不溶性膳食纖維最佳含量為45%。

圖1 香蕉皮水不溶性膳食纖維含量對雙歧桿菌微膠囊包埋產率的影響 Fig.1 Effects of content of water-insoluble dietary fiber in banana peel on embedding yield of Bifidobacteria microcapsules

2.1.2 海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋產率的影響 由圖2可知,在海藻酸鈉濃度在2%～3%時,微膠囊的包埋產率會隨著海藻酸鈉濃度的增加而增大。當海藻酸鈉濃度達到3%時,包埋產率達到最大值65.39%。若海藻酸鈉濃度繼續增大,包埋產率則明顯降低。出現上述結果的原因可能是海藻酸鈉的濃度對形成微膠囊的機械強度有一定影響。海藻酸鈉濃度過低時,三種壁材混合所形成的壁膜過薄,機械強度低,從而影響了包埋效果。海藻酸鈉濃度合適時,可與固化液中的Ca2+結合充分,膜結構致密穩定[15]。但海藻酸鈉濃度過高時,其黏度增大,微膠囊容易聚集成團,黏連較嚴重,導致溶液擠出困難。綜合考慮各種因素,海藻酸鈉濃度選擇3%較合適。

圖2 海藻酸鈉濃度對雙歧桿菌微膠囊包埋產率的影響Fig.2 Effects of concentration of sodium alginate on embedding yield of Bifidobacterium microcapsules

2.1.3 卡拉膠濃度對微膠囊包埋產率的影響 由圖3可知,當卡拉膠濃度在2%～4%范圍內,微膠囊的包埋產率與卡拉膠濃度呈正相關。這是由于卡拉膠濃度較低時,其硫酸基團所攜帶的負電荷較少[17],與溶液中其他物質所攜帶的正電荷結合不充分,導致微膠囊的密度不夠。當卡拉膠濃度超過4%并持續增加時,包埋產率稍微降低，是因為卡拉膠在復合壁材中的比例增加,黏度增大,會給微膠囊的擠出過程帶來一定的困難。當卡拉膠濃度從5%繼續增大,包埋產率隨之變大,但此時卡拉膠與其他壁材配比失衡,微膠囊擠壓到固化液中并不能形成完整的球形?？紤]到微膠囊的形態,卡拉膠濃度不宜過大,建議選擇濃度為4%～6%。

圖3 卡拉膠濃度對雙歧桿菌微膠囊包埋產率的影響Fig.3 Effects of concentration of carrageenan on embedding yield of Bifidobacterium microcapsules

2.1.4 低聚果糖濃度對微膠囊包埋產率的影響 由圖4可知,當低聚果糖濃度從1%～3%時,其包埋產率與低聚果糖濃度呈正相關。當低聚果糖濃度為3%時,微膠囊的包埋產率達到最大值60.10%。此時,壁材和芯材所形成的網狀結構致密程度較高,在微膠囊中的雙歧桿菌活菌不易泄露出來。低聚果糖濃度繼續增加,包埋產率呈下降的趨勢。可能是由于低聚果糖濃度過高,改變了整個體系的濃度;導致滲透壓升高,使細菌活性受到影響,進而影響包埋產率。綜合考慮各種因素后,低聚果糖濃度選擇3%為宜。

圖4 低聚果糖濃度對雙歧桿菌微膠囊包埋產率的影響Fig.4 Effects of concentration of fructo oligosaccharide on embedding yield of Bifidobacteria microcapsules

2.1.5 攪拌時間對微膠囊包埋產率的影響 由圖5可知,當攪拌時間從10～30 min時,雙歧桿菌微膠囊的包埋產率與攪拌時間呈正相關。原因可能是攪拌時間過短,混合溶液正負電荷作用不完全[18]。隨著攪拌時間的增加,微膠囊的交聯度增大,大量雙歧桿菌被包埋。當攪拌時間為30 min時,包埋產率達到最大值64.12%。但此時攪拌時間繼續增加,微膠囊的包埋產率又會變小。這是因為過長的攪拌時間會破壞復合壁材形成的網絡結構,微膠囊密度發生變化,雙歧桿菌重新泄露到溶液中。考慮到實際生產中節能的需要,選擇攪拌時間30 min為宜。

圖5 攪拌時間對雙歧桿菌微膠囊包埋產率的影響Fig.5 Effects of mixing time on embedding yield of Bifidobacteria microcapsules

2.2 最陡爬坡實驗結果

由表2可知,第1、2、3、4、5步爬坡實驗的包埋率分別為42.56%、48.79%、68.79%、55.02%、53.55%。在爬坡實驗的第三步附近時,微膠囊的包埋產率較高。因此可選擇第三步實驗中的因素水平作為Box-Behnken實驗設計的中心點,即香蕉皮水不溶性膳食纖維含量45.00%、海藻酸鈉濃度3.00%、卡拉膠濃度5.50%、攪拌時間30.00 min、低聚果糖濃度3.00%。

表2 雙歧桿菌微膠囊最陡爬坡實驗設計Table 2 Experimental design of the steepest climbing of Bifidobacteria microcapsules

2.3 響應曲面優化實驗結果

2.3.1 回歸模型的建立與分析 由表3可知,響應曲面優化實驗共有46個試驗點。應用軟件Design Expert 10.0.1對實驗結果進行回歸擬合分析,可得到制備雙歧桿菌微膠囊的擬合方程為:

表3 響應面試驗設計與結果Table 3 Experimental design and results of response surface

Y=77.00+7.57A-2.58B+1.63C-11.30D+1.84E-11.48AB-13.40AC-5.70AD-11.53AE+9.27BC+3.43BD+2.36BE+6.14CD+1.43CE-8.40DE-19.07A2-22.40B2-12.83C2-7.32D2-16.45E2+8.72A2B+8.09A2C+17.04A2D-14.55A2E-3.47AB2-12.21AC2-9.29AD2-12.24B2C+14.81B2D-5.66B2E-8.79BC2-5.43BD2+20.78C2D-11.71C2E

表4 回歸方程系數顯著性檢驗表Table 4 Significance checklist of regression equation coefficients

2.3.2 兩因素間交互作用分析 圖6是因素間顯著和極顯著交互項的響應曲面圖,顯示了香蕉皮水不溶性膳食纖維含量、海藻酸鈉濃度、卡拉膠濃度、低聚果糖濃度和攪拌時間中任意三個因素取零水平時,其余兩個因素對微膠囊包埋產率的影響。

圖6 交互項的兩個變量對包埋產率影響的等高線與響應曲面圖Fig.6 Contour lines and response surface maps of effects of two variables of the interaction term on embedding yield

響應面能直觀反映各因素間的影響大小,曲面越陡峭,兩因素之間交互作用越強[20]。由圖6可知,A與B、A與C、A與E、B與C的響應面坡度較陡,說明交互作用較強,其他兩因素之間交互作用則較微弱,幾乎可以忽略不計。

2.3.3 最佳包埋條件的預測及驗證實驗 通過回歸模型的預測,可得到雙歧桿菌BB12微膠囊的最佳包埋工藝為:香蕉皮水不溶性膳食纖維含量45.69%、海藻酸鈉濃度2.72%、卡拉膠5.61%、低聚果糖2.60%、攪拌時間31.13 min。此時微膠囊的理論包埋產率為73.06%。為了驗證試驗結果是否與真實情況相一致,進行了近似驗證實驗。最佳工藝條件修正為香蕉皮水不溶性膳食纖維含量46.00%、海藻酸鈉濃度2.70%、卡拉膠5.60%、低聚果糖2.60%、攪拌時間31.00 min。在此條件下進行3 次平行試驗,平均值為73.02%±0.54%,與微膠囊理論包埋產率的相差百分率為0.05%,表明最佳工藝條件的穩定性較好。

2.4 微膠囊表征與分析

2.4.1 紅外光譜分析 由圖7a可知,香蕉水不溶性膳食纖維在3454 cm-1處附近有寬而強的吸收峰,屬于分子間或分子內的O-H伸縮振動峰;2851 cm-1處附近的吸收峰是糖環或支鏈上C-H(-CH2)伸縮振動峰;1592 cm-1的吸收鋒屬于苯環骨架伸縮振動峰;1156和1078 cm-1處附近的吸收峰屬于纖維素和半纖維素結構中兩種C-O伸縮振動峰,即C-O-H和糖環上C-O-C[21];894 cm-1處的吸收峰則是由β構型糖苷鍵引起的吸收峰,這些吸收峰都屬于糖類的特征吸收峰[22]。由圖7b可知,海藻酸鈉在3277 cm-1處的吸收峰歸屬為-OH基的伸縮振動峰,1607和1419 cm-1處的吸收峰分別屬于海藻酸鈉的COO-的對稱伸縮振動和不對稱伸縮振動[23]。由圖7c可知,卡拉膠在2926 cm-1有強的吸收帶,是因C-H2的存在,1232 cm-1左右為硫酸酯基中S=O伸縮振動峰,930 cm-1為3,6-內醚半乳糖上的SO4(直立鍵)吸收峰,在848 cm-1為C4位硫酸根的吸收峰[24]。比較水不溶性膳食纖維、海藻酸鈉與卡拉膠及壁材混合物的紅外圖譜(見圖7d)可發現,壁材仍然可見水不溶性膳食纖維、海藻酸鈉與卡拉膠的振動吸收,但1000～1600 cm-1范圍波形與壁材單一成分不完全重合,1419、1232、1156 cm-1處吸收峰分別左移至1415、1222、1154,2995～3791 cm-1變為平滑的寬峰,可能與壁材成分之間形成了化學鍵有關。

圖7 壁材單一成分、壁材、芯材和微膠囊的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of single composition,wall,core and microcapsules注:a:香蕉皮水不溶性膳食纖維,b:海藻酸鈉,c:卡拉膠,d:壁材,e:芯材,f:微膠囊。

由圖7e可知,芯材(雙歧桿菌含蛋白質)在3000～3600 cm-1范圍有吸收峰,屬于形成氫鍵締合的-OH伸縮振動吸收峰與-NH的伸縮振動吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰;在1653 cm-1處的吸收峰,是蛋白質的酰胺I帶吸收峰,C=O的伸縮振動;1541 cm-1為蛋白質的酰胺II帶吸收峰,是-NH的彎曲振動和C-N的伸縮振動;1240～1245 cm-1是蛋白質的酰胺III帶的吸收峰,由C-N的伸縮振動和N-H的彎曲振動引起的。酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶是蛋白質的特征吸收峰[25]。由圖7(f)可知,微膠囊也具有3000～3600 cm-1多重吸收峰和蛋白質的特征吸收峰;在1155～1439 cm-1范圍吸收減弱,這可能是因為BB12進入壁材形成的空腔后振動受限導致[26]。紅外光譜吸收的變化說明雙歧桿菌包埋在復合壁材中形成微膠囊。

2.4.2 掃描電鏡觀察 擠壓法制備的濕微膠囊,呈圓球狀,直徑為1～2 mm。濕膠囊經冷凍干燥后,用掃描電鏡觀察。由圖8可看出,制得的雙歧桿菌微膠囊粒徑適中。整體上看,依然呈顆粒狀,但邊緣不是很工整。在較高的放大倍數下,微膠囊內部疏松多孔,可能是由于雙歧桿菌微膠囊在真空冷凍干燥的過程中水分散失,造成微膠囊表面和內部的空洞較多[27]。

圖8 微膠囊掃描電鏡照片Fig.8 SEM micrographs of microcapsule

2.5 微膠囊功能特性分析

2.5.1 耐胃酸性質 由表5可知,微膠囊在未經人工胃液浸泡前,活菌數是9.09×106CFU/g;經人工胃液浸泡2 h后,活菌數下降到0.77×106CFU/g,僅下降了一個數量級。而雙歧桿菌菌液的活菌數在人工胃液浸泡前后則發生巨大變化,活菌數從43.00×106CFU/g下降到0.00 CFU/g,表明人工胃液對未微膠囊化的雙歧桿菌有很強的損害作用,而雙歧桿菌微膠囊卻能較好地抵御胃酸。這是因為雙歧桿菌周圍的凝膠體系為菌體提供了一道屏障。

表5 在模擬胃液中菌液和微膠囊活菌數的變化Table 5 Changes in the number of viable bacteria of bacterial fluid and microcapsules in simulated gastric fluid

海藻酸鈉是一種pH敏感性凝膠,在低pH下較為穩定[28];卡拉膠線性大分子內的結構排列及其大分子鏈節的荷電性,使得它具有強烈的反應性、可形成凝膠及高粘度溶液等優異性能[29];水不溶性膳食纖維則可以起到增強壁材的作用[30]。三者復合形成的壁材可減少胃酸對菌體的傷害,使得微膠囊化的雙歧桿菌對胃酸的耐受力增強。

2.5.2 耐膽鹽性質 由圖9可知,隨著膽鹽濃度的提高,菌液和微膠囊的活菌數均下降,表明膽鹽溶液對雙歧桿菌有很強的損害作用。但微膠囊化處理的活菌數始終遠遠高于對照組,下降幅度較小?？梢?微囊化的雙歧桿菌對人工膽汁的耐受力遠遠大于未包埋保護的雙歧桿菌。這與壁材的作用分不開,壁材可以增大膽鹽溶液穿越的阻力,從而避免了膽鹽與菌體直接接觸。

圖9 不同濃度膽汁下菌液和微膠囊活菌數的變化 Fig.9 Changes in the number of viable bacteria of bacterial fluid and microcapsules in different concentrations of bile

2.5.3 腸道釋放性 微膠囊經裂解,釋放出雙歧桿菌,會導致溶液內物質增多,透光率下降。由圖10可知,微膠囊在人工模擬腸液中處理的前20 min,透光率迅速下降。20 min后,透光率基本穩定,說明大部分濕微膠囊在腸液中20～60 min即可完全崩解,有較好的腸溶性。這是因為海藻酸鈣是依賴于Ca2+形成的可逆性凝膠,解囊液中存在與Ca2+結合能力更強的陰離子PO3-。一旦加入解囊液,Ca2+便會與這種陰離子結合,使凝膠體系破裂[31]。

圖10 在人工模擬腸液中微膠囊雙歧桿菌的溶出 Fig.10 Dissolution of microcapsule Bifidobacterium in artificial simulated intestinal fluid

3 結論

以香蕉水不溶性膳食纖維-海藻酸鈉-卡拉膠為復合壁材,添加低聚果糖作為保護劑,成功制備了雙歧桿菌微膠囊,其最佳工藝條件為香蕉皮水不溶性膳食纖維含量46.00%、海藻酸鈉濃度2.70%、卡拉膠濃度5.60%、低聚果糖濃度2.60%、攪拌時間31.00 min,此條件下,微膠囊的包埋產率為73.02%。影響包埋產率的因素重要性排序為D(低聚果糖濃度)>A(膳食纖維含量)>B(海藻酸鈉濃度)>E(攪拌時間)>C(卡拉膠濃度)。紅外光譜分析表明,壁材各成分之間可能發生了作用,形成了新的物質,雙歧桿菌包埋在復合壁材中并形成微膠囊;掃描電鏡顯示微膠囊呈粒狀,內部疏松多孔。在模擬消化的實驗中,微膠囊化的雙歧桿菌BB12在人工胃液、膽汁中的耐受性均高于未包埋保護的益生菌;微膠囊在人工腸液處理20 min后,透光率基本穩定,溶出性能良好。本研究能較好地解決雙歧桿菌抵抗不良環境的能力差的問題,增強雙歧桿菌的存活性能,可為雙歧桿菌微膠囊在食品中的應用及開發新型益生菌產品奠定基礎,且具有積極的生產實際意義。