甘草超濾液中甘草酸的絡合萃取研究

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(甘肅中醫藥大學藥學院,甘肅蘭州 730000)

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)作為藥食兼用品種,其性味甘平,歸心、肺、脾、胃經,具有補脾益氣、祛痰止咳、清熱解毒、緩急止痛、調和諸藥等功效[1]。甘草酸是甘草中的主要有效成分之一[2]。現代研究證實甘草酸具有抗炎、抗過敏、抗氧化、免疫調節、抗病毒、抗癌、保肝等多種作用[3]。此外甘草酸還是天然甜味劑,其甜度為蔗糖的200～300倍,可廣泛用于食品、醫藥、化妝品、卷煙等行業,應用非常廣泛[4-5]。

目前通常采用水浸提,經酸沉得甘草酸粗品,再用重結晶、大孔樹脂吸附等方法純化甘草酸的生產工藝[6]。該工藝周期長、純化過程復雜,成本高,而且甘草酸得率低,浪費藥材資源。針對上述問題,本文將超濾作為前置技術,處理甘草水提取液,再采用絡合萃取技術萃取分離甘草超濾液中的甘草酸。

絡合萃取技術分離極性有機物稀溶液的實施關鍵為絡合萃取體系的選定,主要包括絡合劑、稀釋劑選擇及混合絡合萃取劑組成研究等內容。本文以前期課題組在研究甘草水提取液超濾工藝的基礎上[7],擬通過改變混合絡合萃取劑組成(絡合劑、稀釋劑種類)及各組分的體積分數,研究萃取劑組成對甘草超濾液中甘草酸絡合萃取效果的影響,為采用超濾-絡合萃取技術制備較高純度甘草酸提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草藥材 蘭州市黃河藥材市場;甘草酸銨對照品(批號110731-201619)、甘草苷對照品(批號111610-201607) 中國食品藥品檢定研究院;磷酸三丁酯(TBP) 煙臺市雙雙化工有限公司;三烷基氧化磷(TRPO) 溧陽市凱信化工有限公司;磺化煤油 廣東正茂石化有限公司;石油醚 天津市進豐化工有限公司；乙腈 國產色譜純;其他試劑 均為國產分析純。

Agilent-1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;ABT100-5M電子天平 德國KERN公司;MX-RL-Pro LCD數控旋轉混勻儀 大龍興創實驗儀器北京有限公司;DD-5M 湘儀離心機 湘儀離心機儀器有限公司;DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;SJM陶瓷超濾設備超濾膜(50 nm) 合肥世杰膜工程有限公司;BDS HYPERSIL-C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;AKRY-UP-1816型超純水機 成都唐氏康寧科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甘草的提取 稱取一定量甘草藥材(已切片,厚度2～4 mm),采用普通加熱回流提取法,每次用藥材質量8倍量的0.75%(V/V)的氨水提取1 h,重復提取3次,合并提取液。放置過夜(12 h)后取上清液,剩余藥液經3 000 r/min常溫離心15 min,收集上清液,合并上清液,在孔徑50 nm、壓力0.12 MPa、溫度25 ℃的條件下用無機陶瓷膜超濾,得甘草超濾液,置搪瓷方盤水浴(94 ℃)濃縮至甘草生藥量為0.2 g/mL,冷卻至室溫,備用[7]。

1.2.2 甘草超濾液中甘草酸及甘草苷的萃取 取10 mL 1.2.1中得到的甘草超濾液于50 mL離心管中,再加入10 mL按比例配好的絡合萃取劑,將離心管固定在旋轉混勻儀上常溫萃取12 h(25 r/min),取出,常溫離心10 min(4000 r/min),取1 mL下層萃余液于50 mL容量瓶中,用70%乙醇定容。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 不同稀釋劑對甘草酸萃取效果的影響 根據稀釋劑的物理、化學特性,本文選擇惰性溶劑磺化煤油、非極性溶劑石油醚作為稀釋劑。以甘草酸的萃取率和甘草酸與甘草苷的分離率為指標,分別以TRPO和TBP為絡合劑,與各稀釋劑構成二元混合萃取劑對甘草超濾液進行萃取。在一定濃度范圍內,絡合劑濃度越高越有利于生成絡合物,但超過該濃度范圍會形成中間相[6,9]。為避免中間相的產生,結合文獻和甘草超濾液自身特性,先將絡合劑與稀釋劑按10%(V/V)絡合劑+90%(V/V)稀釋劑的比例混合,按1.2.2中方法制備樣品并進行測定分離率及萃取率,考察稀釋劑種類對萃取效果的影響。

1.2.3.2 不同絡合劑對甘草酸萃取效果的影響 在上述實驗的基礎上,選擇磺化煤油為稀釋劑,分別與不同濃度(10%、20%、30%、40%、50%、60%,V/V)的TBP和不同濃度(5%、10%、15%,V/V)的TRPO構成二元混合萃取劑,對甘草超濾液進行萃取。按1.2.2中方法制備樣品并進行測定,考察絡合劑種類和濃度對甘草酸萃取效果的影響。

1.2.4 三元絡合萃取劑對甘草酸萃取率的影響 為了進一步提高甘草酸的萃取率,將TRPO+TBP+磺化煤油構建為三元絡合萃取劑,以甘草酸的萃取率為指標,通過析因實驗考察TBP、TRPO在絡合萃取甘草酸時是否具有協同作用。將TBP和TRPO的濃度確定為析因實驗的兩個因素,每個因素取3個水平進行實驗,以期優選出最佳的混合萃取劑。實驗因素、水平設計見表1。

表1 析因實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of factorial experiment

1.2.5 甘草酸和甘草苷的含量測定

1.2.5.1 對照品溶液的制備 分別取甘草酸銨和甘草苷對照品適量,精密稱量,加70%乙醇制成含甘草酸銨0.216 μg/μL、甘草苷0.0225 μg/μL的混合對照品溶液,備用[8]。

1.2.5.2 甘草超濾液供試品溶液的制備 精密量取1.2.1中得到的甘草超濾液1 mL于50 mL容量瓶中,加70%乙醇定容,搖勻,備用。

1.2.5.3 色譜條件 色譜柱為BDS HYPERSIL-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);進樣量10 μL;以乙腈為流動相A,以0.05%(V/V)磷酸溶液為流動相B,按表2中的規定進行梯度洗脫;流速1 mL/min;柱溫26 ℃;測定波長237 nm[8]。

表2 梯度洗脫表Table 2 The table of gradient elution

1.2.5.4 標準曲線測定 分別精密吸取1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL混合對照品溶液,注入高效液相色譜儀測定,以峰面積為縱坐標(Y),進樣量為橫坐標(X)作回歸曲線,得甘草酸回歸方程:Y=140.5X-24.746,R2=0.9999,線性范圍0.216～4.320 μg;甘草苷回歸方程:Y=35.121X+18.267,R2=1,線性范圍0.0225～0.45 μg。

1.2.5.5 甘草超濾液樣品定量測定 將1.2.5.2中方法制備的甘草超濾液樣品按1.2.5.3中條件進行測定,并按回歸方程計算甘草酸和甘草苷量。

1.2.6 萃取率與分離率的計算

萃取率(%)=100-[萃余液中甘草酸量(甘草苷量)/甘草超濾液中甘草酸量(甘草苷量)]×100

分離率(%)=|甘草酸萃取率(%)-甘草苷萃取率(%)|

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同稀釋劑對甘草酸萃取效果的影響 由表3和表4可知,以磺化煤油為稀釋劑時,絡合劑TRPO、TBP對甘草酸的萃取率均高于以石油醚為稀釋劑時的萃取率,同時以磺化煤油為稀釋劑時，甘草苷與甘草酸的分離率也高于石油醚。因此選擇磺化煤油作為稀釋劑。

表3 不同稀釋劑對TRPO萃取甘草酸的影響Table 3 Effects of different diluents on the extraction of glycyrrhizic acid by TRPO

表4 不同稀釋劑對TBP萃取甘草酸的影響Table 4 Effects of different diluents on the extraction of glycyrrhizic acid by TBP

2.1.2 不同絡合劑對甘草酸萃取效果的影響 由表5可知,10%～50%(V/V)濃度范圍內隨著TBP濃度增加,甘草酸的萃取率呈上升趨勢,但60% TBP對甘草酸的萃取率低于50% TBP。這可能是由于TBP濃度增大時,萃取相粘度隨之增大,當TBP 濃度達到60%左右時,開始出現乳化現象所致,故選擇60% TBP作為下一步析因實驗第一個因素的最大水平。由表6可知,5% TRPO對甘草酸的萃取率最高,但在5%～15% TRPO范圍內,隨著體系中TRPO的濃度增大,甘草酸的萃取率逐漸降低,因此后續實驗TRPO的濃度梯度為3%、6%、9%。另外,在表5中,50% TBP+50%磺化煤油對甘草酸的萃取率最高,為30.73%,但甘草苷與甘草酸的分離率僅為10.43%;而在表6中,15% TRPO+85%磺化煤油對甘草苷的萃取率高達99.59%,但對甘草酸的萃取率僅有8.28%。實驗結果表明TBP與TRPO各有優勢,TBP更適用于萃取甘草酸,而TRPO更適用于萃取甘草苷,若既要絡合萃取出超濾液中的甘草酸,又要實現與甘草苷的分離,則需二者配合使用,因此TBP和TRPO均有作為絡合劑的可能。

表5 TBP濃度對甘草酸萃取及分離效果的影響Table 5 Effects of TBP concentration on extraction and separation of glycyrrhizic acid

表6 TRPO濃度對甘草酸萃取及分離效果的影響Table 6 Effects of TRPO concentration on extraction and separation of glycyrrhizic acid

2.2 三元絡合萃取劑對甘草酸萃取率的影響

由表7可知,對超濾液中甘草酸的萃取率最高的萃取劑組合為2/2組,即6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油,最高萃取率為32.98%±0.04%,高于兩元絡合萃取劑。由表8分析結果可看出,TRPO濃度、TBP濃度、以及TRPO與TBP的交互作用都對甘草酸的萃取率有極顯著影響(p<0.01)。

表8 實驗結果的方差分析表Table 8 Variance analysis table of experimental results

表7 不同萃取劑組合對甘草酸萃取率的影響(n=3)Table 7 Effects of different extractant combinations on extraction yield of glycyrrhizic acid(n=3)

因此,本文擬用兩步萃取法制備甘草酸,即先用對甘草苷的單次萃取率和甘草酸與甘草苷的分離率均最高的15% TRPO+85%磺化煤油作為萃取相,萃取甘草超濾液中的甘草苷,將甘草酸盡可能多的留在水相中,再用三元混合萃取劑6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油萃取已經移取甘草苷的萃余水液,得到純度較高的甘草酸。

3 討論

3.1 在甘草酸的絡合萃取中超濾甘草提取液的必要性

甘草水提取液中含有大量水溶性淀粉、蛋白質、果膠等大分子雜質,這些水溶性大分子的存在會顯著增大料液粘度,而粘度是油水乳化的主要影響因素之一,萃取過程中油水乳化程度隨粘度的增大而增加[10]。同時由于甘草酸有微弱的表面活性作用,因此在對甘草水提取液的萃取過程中乳化現象非常嚴重。乳化現象是將萃取技術用于甘草水提取液中甘草酸分離時必須解決的問題。

本文將超濾作為絡合萃取的前處理技術,在絡合萃取前將甘草水提取液進行超濾處理,在目標成分得到有效保留的情況下,可以除去其中的大量水溶性大分子雜質,使料液粘度顯著降低,乳化現象大為改善,使甘草酸的絡合萃取過程可以順利進行,絡合萃取劑的使用濃度顯著提高[6],有效提高了絡合萃取效率。

3.2 絡合萃取法萃取分離甘草酸的優勢

甘草酸是一種在水中溶解性較好的極性較大有機物,要將它和甘草水提取液中極性接近的黃酮類物質分開,如采用傳統的物理萃取需要采用極性較大的有機溶劑,不但有機溶劑在水中的溶解損失較大,而且很難達到精確分離。

絡合萃取是一種化學萃取的方法,其基本原理是根據待分離溶質的Lewis酸堿性質,選擇合適的絡合萃取劑與極性較大有機物形成絡合物,并在有機相中得到富集,絡合萃取過程中的化學反應有較高的選擇性[11]。富集于有機相的絡合物可在反萃取過程中分解重新得到極性較大有機物,達到分離純化的目的。在萃取過程中水相中為極性有機物,有機相中為該有機物的絡合物,為兩種不同物質。萃取過程的推動力是待分離成分和絡合劑間的化學鍵能,因此即使料液中待分離成分濃度很低,絡合萃取的分配系數也會很大[12]。該技術對于分離極性較大的有機物稀溶液具有很高的應用價值。采用絡合萃取不但有利于甘草酸和黃酮類物質的高效分離,而且通過反萃取可實現絡合萃取劑的循環使用,有效解決物理萃取方法萃取劑損失大、產品溶劑殘留、工藝成本高等技術缺陷。

3.3 稀釋劑的選擇

稀釋劑是絡合萃取劑的主要組成成分,具有調節混合萃取劑粘度、密度及界面張力等參數,降低混合萃取劑萃水量的作用,因此稀釋劑的選擇是研究絡合萃取工藝的主要內容[13]。本文分別以磺化煤油和石油醚為稀釋劑,考察了不同類型稀釋劑對甘草超濾液中甘草酸萃取效果的影響,發現以磺化煤油為稀釋劑時,對甘草酸的萃取率以及甘草苷與甘草酸的分離率均高于石油醚。

絡合萃取效率與混合萃取劑對萃合物的溶解能力正相關[13]。本文研究表明以磺化煤油為稀釋劑對甘草酸有較好的萃取效率,說明磺化煤油不但可以有效降低絡合萃取劑的粘度,減小傳質阻力,而且對甘草酸萃合物有很好的溶解能力。此外磺化煤油在水中不溶,以其為稀釋劑組成的混合絡合萃取劑的水溶性小,萃取過程中溶劑流失少,通過萃取劑再生循環使用可有效降低生產成本。

3.4 三元絡合萃取劑的協同效應

在以TBP為絡合萃取劑，磺化煤油為稀釋劑時,在TBP的使用濃度50%時甘草酸的萃取率30.73%。由析因設計得到的6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油對甘草酸的單次萃取率為32.98%±0.04%。顯示三元絡合萃取劑對甘草酸的萃取有協同作用,可在一定程度上提高萃取效率。

4 結論

選用的兩種絡合萃取劑對甘草酸和甘草苷均有一定的絡合萃取作用,為制備純度較高的甘草酸,擬用兩步萃取法,由于15% TRPO+85%磺化煤油的混合萃取液對甘草超濾液中甘草苷的單次萃取率為99.59%,甘草酸與甘草苷的分離率為91.31%;故可先用該混合萃取劑萃取甘草超濾液中的甘草苷,將甘草酸留在水相中。再用實驗優化出的三元混合萃取劑6% TRPO+50% TBP+44%磺化煤油萃取已經移取甘草苷的萃余水液,得到純度較高的甘草酸。該兩步絡合萃取法既能得到甘草酸,同時還可收集到副產品甘草苷。