嬰兒豆基粉中低植酸低異黃酮蛋白基料的制備工藝研究

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(1.植物蛋白與谷物加工北京市重點實驗室,中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.北京康得利智能科技有限公司,北京 100074)

大豆含有較為豐富的水溶性蛋白質,主要為球蛋白(94%)和白蛋白(6%),這兩種蛋白質與牛乳中的乳清蛋白特性相似,易被嬰兒吸收[1]。因此嬰兒豆基配方粉是目前市場上被廣泛作為牛乳配方粉的替代產品。而嬰兒豆基配方粉與乳基配方粉最關鍵的區別則在于蛋白質基料的不同,目前市面上的幾乎都采用大豆分離蛋白(Soy Protein Isolate,SPI)作為豆基嬰兒配方粉中的蛋白質基料[2-3]。大豆分離蛋白以豆粕為原料,通過“堿溶酸沉”法制備而得,蛋白含量達90%以上,消化率可達97%以上,富含豐富必需氨基酸[4],是所有植物蛋白粉中的最優蛋白產品,同時還具有營養、方便、價廉的優點。與此同時,現有的豆基配方粉產品中還強化了蛋氨酸、左旋肉堿和?；撬岬任镔|,因此其營養素分布也更接近于乳基配方粉,適合大部分嬰兒食用[5-6]。

但由于嬰兒食用豆基配方粉的歷史較短,現缺少相關充足可靠的數據去判斷豆基配方粉對人體長期的健康是否會造成影響。而豆基粉中仍存在許多影響其食用安全性的成分,如各類抗營養因子、致敏蛋白和金屬Al等。歐洲小兒胃腸營養學會(European Society for Paediatric Gastroenterology,Hepatology,and Nutrition,ESPGHAN)發表的一篇使用嬰兒豆基粉的說明中指出:生產商應該致力于減少嬰兒豆基粉中胰蛋白酶抑制劑、凝集素、致甲狀腺腫的物質、植酸、鋁以及植物雌激素的含量[7]。

在影響豆基粉食用安全性的成分中,植酸和異黃酮是對嬰兒成長和發育影響最為嚴重的兩種成分。植酸可以螯合食物中的金屬離子,形成不溶性復合物,影響機體對礦物質(如鈣、鐵、鋅)的吸收[8-11]。異黃酮類性激素可能會影響嬰兒的分泌系統、生殖系統,對將來發育產生影響,嬰兒食入較多的異黃酮會還影響其免疫系統、神經行為和甲狀腺功能的發育等[12-14]。然而,對現有市售豆基配方粉產品檢測發現,市售產品中均含有一定量的異黃酮(307.3±27.8) μg/g和植酸250～300 mg/kg[15-16],而這些成分均來源于配方粉中的蛋白質基料——大豆分離蛋白。因此,要提高豆基配方粉的食用安全性,則需要蛋白生產企業致力于提供安全性更高的嬰兒專用大豆蛋白產品。

因此,本研究從創新大豆蛋白制備工藝角度出發,對大豆進行磨漿浸提制漿,再通過酸沉、水洗等工藝獲得蛋白產品,研究蛋白制備工藝和關鍵環節對蛋白提取率、植酸和異黃酮去除率的影響,比較不同加工工藝對蛋白質成分的影響,確定可獲得具有更高安全性的蛋白質提取工藝,以提高嬰兒豆基粉中蛋白質的食用安全性,為嬰兒專用豆基蛋白粉的開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫皮大豆、純凈水 市售;考馬斯亮藍G250、金雀異黃素 美國Sigma公司;磷酸氫鈉、HCl、NaOH、尿素、丙烯酰胺、FeCl3、CaCl2、NaCl、Na2SO4、濃H2SO4、蒽酮、硫脲等 分析純,北京化學試劑公司;β-巰基乙醇、牛血清蛋白 美國Amersco公司;D201大孔樹脂(φ0.8 cm×10 cm) 天津興南允能高分子技術有限公司。

PC-180破碎機 廣州旭眾機械設備有限公司;JYL-350豆漿機 山東九陽小家電有限公司;LXJ-IIB大容量低速離心機 上海安亭科學儀器廠;PP-25 pH計 德國Sartorius公司;90-1磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FD-1C-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;SHJ-A水浴恒溫磁力攪拌器 金壇市華鋒儀器公司;UV1800紫外可見分光光度計、AY220千分之一電子天平 日本SHIMADZU公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;SHI-III循環水力真空泵 上海亞榮生化儀器廠;QL-901旋渦混合儀 海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白浸提液及蛋白粉的制備

1.2.1.1 濕法制備蛋白浸提液及蛋白粉 稱取50 g脫皮破碎(過6目篩)大豆于500 mL燒杯中,自來水清洗三遍后再用蒸餾水清洗兩遍,加入150 mL蒸餾水在4 ℃條件下浸泡12 h使大豆充分吸水溶脹,濾去多余的水分,再加入20 ℃的蒸餾水,使大豆料液總重量達400 g。轉入打漿機中打漿3次,每次40 s,再用120目的尼龍網過濾兩次,除渣即得到濕法蛋白浸提液。凍干制粉,即得濕法蛋白粉產品。

1.2.1.2 熱燙法制備蛋白浸提液及蛋白粉 稱取50 g脫皮破碎(過6目篩)大豆于500 mL燒杯中,自來水清洗三遍后再用蒸餾水清洗兩遍,加入150 mL蒸餾水在4 ℃條件下浸泡12 h使大豆充分吸水溶脹,濾去多余的水分。向盛有膨潤大豆的400 mL燒杯中,加入150 mL 85 ℃的3‰(w/v)NaHCO3溶液,將燒杯轉入85 ℃的恒溫水浴中,在大豆與NaHCO3混合料液溫度達到(85±2) ℃時計時10 min后取出燒杯,再加入85 ℃的蒸餾水,使大豆料液總重量達400 g。轉入打漿機中打漿3次,每次40 s,再用120目的尼龍網過濾兩次,除渣即得到熱燙法蛋白浸提液。凍干制粉,即得熱燙法蛋白粉產品。

1.2.1.3 半干法制備蛋白浸提液及蛋白粉 稱取50 g脫皮的破碎(過6目篩)大豆于500 mL燒杯中,自來水清洗三遍后再用蒸餾水清洗兩遍,濾去多余的水分。向盛有大豆的400 mL燒杯中加入150 mL 85 ℃的3‰(w/v)NaHCO3溶液,將燒杯轉入85 ℃的恒溫水浴中,當NaHCO3與大豆混合料液溫度達到(85±2) ℃時計時10 min后取出燒杯,再加入85 ℃蒸餾水,使大豆料液總重量達400 g。轉入打漿機中打漿3次,每次40 s,再用120目的尼龍網過濾兩次,除渣即得到半干法蛋白浸提液。凍干制粉,即得半干法蛋白粉產品。

1.2.2 蛋白粉中可溶性蛋白質含量的測定 將100 mg考馬斯亮藍G250溶解到50 mL 95%的乙醇溶液中,然后加入100 mL 85%的磷酸,加蒸餾水至800 mL過夜攪拌(10 h左右),使G250充分溶解,定容至1 L,然后在室溫下用兩層定性濾紙抽濾備用。將蛋白粉產品用蒸餾水稀釋50倍,吸取稀釋液0.1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍G250染液,用紫外-可見光分光光度計在595 nm測定吸光值。以牛血清白蛋白制作標準曲線計算蛋白粉樣品中的可溶性蛋白濃度。以可溶性蛋白濃度(mg/mL)為y,吸光值為x,得到標準曲線方程:y=0.8615x+0.1139,r=0.999。

1.2.3 蛋白浸提液總固形物含量的測定 稱取約15 g左右的石英砂于鋁盒中,放入105 ℃烘箱中,烘至恒重,放在干燥器中,冷卻至室溫,稱取其質量(M1)。稱取5 g左右的蛋白浸提液加入該鋁盒,稱取質量(M2)。在105 ℃烘箱中烘干,至連續兩次稱重質量之差小于0.0002 g。記錄最后兩次稱重平均值(M3),計算蛋白浸提液總固形物含量公式如下:

1.2.4 大豆轉化率的計算 大豆轉化率為一定質量的大豆制漿后獲得蛋白浸提液的固形物質量占到原料大豆質量的百分比。計算大豆轉化率公式如下:

大豆轉化率(%)=(浸提液得率×固形物含量)×100/原料大豆凈重

1.2.5 植酸含量的測定 采用Latta等[17]報道的離子交換比色方法加以改進。將50 g無水硫酸鈉溶于500 mL 1%的鹽酸溶液,用于樣品中植酸的提取。取10 g樣品,與50 mL上述的硫酸鈉/鹽酸溶液混合,室溫攪拌2 h。混濁的提取液經過玻璃三角漏斗過濾一次后收集濾液。取10 mL濾液加入30 g/L NaOH和19 mL去離子水,混合后緩慢注入填有0.5 g AX1-G4強堿型陰離子樹脂的離子交換柱(Ф 0.8 cm×10 cm)中。樹脂先后由15 mL純凈水和15 mL 0.05 mol/L的氯化鈉溶液洗脫,棄去洗脫液。最后用0.7 mol/L氯化鈉溶液洗脫,流出液體接收并定容于25 mL容量瓶中。5 mL洗脫液與4 mL改進的Wade試劑(0.03%三氯化鐵和0.3%磺基水楊酸和混合水溶液)混合,靜置20 min于3000 r/min離心10 min后,于500 nm下測定上清的吸光值。用5 mL 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的植酸鈉標品與Wade試劑,以吸光值為橫坐標，以植酸含量為縱坐標，得標準曲線為y=0.9229-1.0525x,r=0.989,并計算樣品植酸的含量。

1.2.6 異黃酮含量的測定 稱取約1.0 g樣品,溶于20 mL的60%乙醇溶液中,震蕩提取2 h,過濾,收集濾液備用。準確稱取大豆總異黃酮純化物金雀異黃素10.4 mg,置入50 mL容量瓶中,以95%乙醇溶解,并定容至刻度,搖勻。準確吸取0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4 mL標準品溶液分別置于10 mL容量瓶中,并各加1.0 mL 95%乙醇,再加蒸餾水稀釋到刻度線,搖勻。以1 mL 95%乙醇加水到10 mL作空白對照,在259 nm處測得吸光值,以測得的吸光值(x)與純品含量(y)繪制標準工作曲線得y=0.1437x+0.0062,r=0.999。

分別準確吸取樣品液0.3 mL置于3只10 mL容量瓶中,按標準曲線制備操作,在259 nm處測定吸光值,計算平均值,按標準曲線的回歸方程計算含量,并計算樣品的大豆總異黃酮質量分數。

1.2.7 不同pH酸沉條件下蛋白粉的制備 稱取100 g脫皮的破碎大豆于500 mL燒杯中,用自來水清洗三遍,再用蒸餾水清洗兩遍,濾去多余的水分,向盛有膨潤大豆的400 mL燒杯中,將300 mL 85 ℃的3‰(w/v)NaHCO3溶液倒入,接著將燒杯置于85 ℃的恒溫水浴中,當NaHCO3與大豆混合料液溫度達到(85±2) ℃時,計時10 min后取出燒杯,再將85 ℃蒸餾水和浸泡后的大豆使其總重量達800 g一起轉入打漿機中,打漿3次,每次40 s,用120目的尼龍網過濾兩次,除渣即得到蛋白浸提液。

待浸提液冷卻至室溫,用6 mol/L HCl和1 mol/L HCl調節pH,分別調節pH至4.51、5.15、5.50、6.00進行酸沉,4000 r/mim離心5 min,沉淀水洗兩次后加水復溶,攪拌均勻,15000 r/min剪切均質5 min,調節蛋白質量分數至3%。凍干后測定植酸及異黃酮含量。

1.2.8 去乳清蛋白粉的制備 蛋白浸提液的制備同1.2.7。待浸提液冷卻至室溫,用6 mol/L HCl和1 mol/L HCl調節pH,調節pH至5.15進行酸沉,4000 r/mim離心5 min,分別保留0、20%、40%、60%、80%、100%的乳清含量,沉淀水洗兩次后加水復溶,攪拌均勻,15000 r/min剪切均質5 min,調節蛋白質量分數至3%。凍干后測定植酸及異黃酮含量。

1.3 數據處理

所有試驗均進行重復,結果取其平均值±標準差。實驗數據采用Microsoft、Excel和SPSS軟件進行分析處理和方差分析,利用Origin 8.0軟件進行繪圖,通過單因素方差分析對實驗數據進行差異顯著性分析,當p<0.05時,認為數據間存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 制漿方法對大豆轉化率、可溶性蛋白及固形物含量的影響

大豆轉化率、可溶性蛋白和固形物含量是體現原料利用率的重要指標。其含量越高,原料利用率就越高。分別比較不同方法的大豆轉化率、可溶性蛋白和固形物含量,結果如圖1和圖2所示。

圖1 不同方法制備蛋白浸提液大豆轉化率和可溶性蛋白含量Fig.1 Yield and soluble protein content of protein extraction solution in different methods注:不同字母表示統計學上差異顯著(p<0.05),圖2～圖5同。

圖2 不同方法制備的浸提液固形物含量Fig.2 Solid content of protein extraction solution in different methods

由圖1可知,三種方法中,以濕法的大豆轉化率含量和可溶性蛋白含量最高,其中大豆轉化率比熱燙法和半干法分別高了7.89%和4.06%,均表現出顯著性差異(p<0.05),可溶性蛋白含量分別高了17.17%和4.27%,與熱燙法呈顯著差異(p<0.05),但與半干法差異不顯著(p>0.05)。熱燙法和半干法均采用85 ℃熱水磨漿,85 ℃時7S球蛋白發生變性,從而導致浸提液中大粒徑粒子蛋白的增加,浸提液整體穩定性降低[18],因此經過后續的過濾環節,大粒子蛋白被截留,其轉化率和可溶性蛋白質含量均低于采用冷磨制漿的濕法工藝。此外,熱燙法中對大豆浸泡液采用85 ℃的NaHCO3熱燙10 min,其7S球蛋白變性程度更劇烈,降低了浸提液的可溶性蛋白粒子含量,因此轉化率最低。

如圖2，在固形物含量比較中,濕法、熱燙法和半干法的固形物含量分別為8.35%、8.86%、10.45%,即濕法和熱燙法的固形物含量較半干法制得的浸提液含量低,呈顯著性差異(p<0.05)。大豆在浸泡過程中,部分物質和蛋白質會溶出到浸泡液中,并隨著浸泡液的廢棄而損失[19],而且去皮大豆由于減少了種皮的阻隔,其可溶性固形物成分更容易浸出[20]。而半干法未經過浸泡處理,有效保留了浸泡液中的成分,因此其固形物含量更高。

2.2 制漿方法對蛋白粉中的植酸和異黃酮含量的影響

植酸能與二價或三價的金屬離子螯合形成難溶性的植酸鹽絡合物,從而影響人體對礦物質的吸收[8-11],而較多的異黃酮會對幼年動物的生殖系統、免疫系統、甲狀腺發育等造成影響[12-14]。因此本研究對不同制漿方法所得蛋白粉產品的植酸和異黃酮含量進行對比,確定蛋白浸提液最優制備工藝。

從圖3可知,三種方法中,濕法和熱燙法蛋白粉中的植酸含量均低于半干法蛋白粉植酸含量,差異顯著(p<0.05)。這可能是因為前兩者都是經過浸泡處理,大豆中的部分游離植酸隨著可溶性成分一起浸出,從而導致了植酸含量的降低。而在異黃酮含量方面,熱燙法和半干法的異黃酮均高于濕法,但差異不顯著(p>0.05)。從處理溫度上來說,由于熱燙法和半干法都采用了85 ℃的NaHCO3溶液熱燙處理,因此又可統稱為熱磨漿法,而濕法未經過該處理的則可稱為冷磨漿法。染料木素和大豆苷元及其各自的糖苷是豆基配方食品中異黃酮的主要存在形式,由于大豆中丙二?；惢衔锞哂胁环€定性,熱燙處理可使之脫去二氧化碳,從而形成乙酰糖苷或糖苷配基,造成大豆苷元的增加[21-22],因此熱磨漿法略高于冷磨漿法。

圖3 不同蛋白粉制備方法的植酸和異黃酮含量Fig.3 Contents of phytate and isoflavones of protein powder in different preparation methods

浸泡大豆一方面可以使大豆吸水膨脹,便于磨漿;另一方面使大豆組織中的蛋白質等溶質較容易的被提取出來[20]。但隨著傳統豆制品生產企業的規?；同F代化發展,濕法工藝在工業化中生產中問題越來越突出,如生產耗水大,浸泡設備占地面積大,浸泡時間長等。而半干法未經浸泡,直接在80～85 ℃下熱燙對脂肪氧化酶進行滅酶,再進行磨漿處理,且可以鈍化脂肪氧化酶、脲酶的活性,同時減少了浸泡的工藝流程,節省了生產時間。而在本研究中,半干法浸提液的大豆轉化率、蛋白含量和異黃酮含量居于三者中間。因此綜合考慮到生產工藝的連續性和即時性,半干法工藝最簡單、耗時最短,選用半干法浸提為蛋白質首選提取方法。

2.3 酸沉條件對蛋白粉植酸和異黃酮含量的影響

從圖4A可知,蛋白粉中植酸含量隨pH的升高而呈下降趨勢。但當pH≥5.15時,植酸的含量無顯著差異(p>0.05)。有研究曾發現,在pH高于等電點、接近于5.3的條件下酸沉分離大豆蛋白,可以有效降低大豆分離蛋白中的植酸含量[23-24]。李雯[25]的研究也表明,在pH5.3附近能夠有效降低大豆分離蛋白中的植酸含量。

圖4 不同pH酸沉處理的蛋白粉中植酸和異黃酮含量Fig.4 Contents of phytate and isoflavones of protein powder in different pH acid precipitation

大豆異黃酮含量則與植酸含量相反,隨pH的升高而呈升高趨勢(如圖4B所示)。在pH4.50、5.15、5.50、6.00的條件下進行酸沉處理浸提液時,蛋白浸提液中含有的異黃酮含量分別降低了55.0%、49.7%、47.4%、38.3%,異黃酮含量隨著酸沉pH的降低而降低。研究表明,pH5.3條件下處理大豆分離蛋白,其中的大豆異黃酮含量較未處理的也有所下降[25]。因此,在pH5.15酸沉處理浸提液可有效去除部分植酸和大豆異黃酮含量,獲得植酸和黃異酮含量較低的蛋白粉產品。

2.4 乳清含量對蛋白粉中植酸和異黃酮含量的影響

蛋白浸提液經酸處理后發生沉淀,沉淀部分即為蛋白質,上清部分即為乳清。因此在蛋白質提取工藝中,離心去除乳清即可獲得蛋白質。但僅一次離心不可能完全去除乳清溶液,因此在實驗室制備蛋白質時,通常會將沉淀蛋白質加水水洗離心2～3次,使其它組分可以去除更充分,蛋白質的純度和提取率也更高。然而在現有工廠生產中,為提高生產效率，蛋白質的離心處理通常采用臥螺式連續離心,而連續式離心處理不可去除所有乳清,因此植酸和異黃酮也會隨之有部分保留。為明確乳清的存留量對植酸和異黃酮的影響,本研究對不同乳清保留量下植酸和異黃酮的殘留量進行分析,結果如圖5所示。從圖5中可知,乳清保留量在40%以下時,植酸含量與完全去除乳清時無顯著顯異(p>0.05),但當乳清保留量達40%以后,植酸含量顯著增加(p<0.05);而異黃酮含量隨乳清保留量的增加呈顯著增加趨勢(p<0.05)。因此綜合考慮,在工廠生產時,若乳清保留量能控制在20%以內,則植酸和異黃酮的含量可以得到較好的控制。其蛋白質植酸和異黃酮含量分別為(12.08±0.46) mg/g和(1468±74) μg/g,較普通大豆分離蛋白中的植酸(19.86±0.56) mg/g和異黃酮(2108±176) μg/g[6,26]分別降低了39.17%和30.36%。

圖5 不同乳清含量的蛋白粉中植酸和異黃酮的含量Fig.5 The content of phytate and isoflavones of protein powder with different whey fraction

3 結論

本研究確定了可獲得安全性更高的大豆蛋白制備工藝:當采用半干法制備蛋白浸提液,在pH5.15時酸沉浸提液再水洗離心提取大豆蛋白質,且體系中乳清保留量低于20%時,可以較好的控制植酸和異黃酮的殘留量。利用此方法所獲得的蛋白質植酸和異黃酮含量分別為(12.08±0.46) mg/g和(1468±74) μg/g,低于普通大豆分離蛋白粉,提高了蛋白質基料的安全性,為進一步開發為高安全性的嬰兒專用大豆蛋白基料奠定了基礎。