墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝優化及純化

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(1.寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211;2.寧波大學科學技術學院,浙江寧波 315211)

墨魚是軟體門,頭足綱,十腕目,烏賊科,也叫目魚、烏賊魚等,中國的墨魚大多源自中國東海,有曼氏無針烏賊和金烏賊兩個種。墨魚是我國著名的海產品之一,與大黃魚、小黃魚、帶魚統稱為“四大經濟魚類”,深受廣大消費者喜愛[1]。墨魚纏卵腺是雌性生殖腺的附屬腺,因形似禽蛋,所以又稱墨魚蛋,墨魚蛋營養豐富,解暑驅寒,具有開胃利水的功效,是我國古代八珍之一[2]。

糖蛋白是由分支的寡糖鏈與多肽鏈共價結合形成的一類重要的生物大分子,在生物體中有著至關重要的作用。研究發現細胞識別、免疫保護、代謝調控等都與糖蛋白中的糖鏈有關[3-4]。近年來,國內外研究人員對糖蛋白的研究越來越重視,根據糖蛋白的溶解性不同,研究人員通過水提法、鹽提法、酸堿提法及有機溶劑等方法提取生物體中的糖蛋白。包郁明等[5]通過丙酮脫脂、NaCl溶液超聲浸提、硫酸銨分級沉淀、透析,柱層析等從鮑魚臟器中提取了一種糖蛋白,經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳發現,該糖蛋白純度達到電泳純,分子質量為73.7 kDa。王倩等[6]采用NaOH溶液在魷魚纏卵腺中提取了糖蛋白,經響應面優化工藝,得出魷魚纏卵腺糖蛋白的最佳提取工藝為提取時間3.44 h,提取溫度25 ℃,NaOH濃度為0.37 mol/L,在此工藝條件下糖蛋白提取率為12.79%。隨著海洋生物的深入研究,關于海洋生物中糖蛋白的研究,也逐漸成為國內外研究的熱門。目前已有從海蜇[7]、海兔[8]、河蜆[9]、魷魚[10]、章魚[11]等海洋生物中提取了糖蛋白,發現其具有顯著的抗氧化、抗疲勞、降血脂等功效。目前尚未有發現墨魚蛋糖蛋白的研究。

糖蛋白的純化是指去除粗糖蛋白中的小分子蛋白、糖等雜質,主要參考蛋白和多糖的純化方法,目前國內外較常用的分離方法有色譜法[12-13]、膜分離法[14]、電泳法[15]。Wang等[16]采用DEAE-52 celloulus陰離子交換柱層析結合凝膠柱層析、電泳法,對大蒜中的糖蛋白進行提純、鑒定,得到一種純度達到電泳純的糖蛋白,為本文的提純方法提供了一定的設計思路。

本課題參考王倩[17]的提取方法在預實驗的基礎上,采用堿法提取,選擇NaOH濃度、提取時間、提取溫度、料液比、超聲功率為單因素,對墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝進行了研究,結合Wang等[16]、Senthilkumar等[18]的方法,運用DEAE-52柱層析、Sephacryl S-300HR柱層析,對糖蛋白粗提物進行純化,得到純化后的糖蛋白再進行SDS-PAGE電泳實驗,鑒定其純度,為后續墨魚纏卵腺糖蛋白的結構及生物活性研究提供基礎保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨魚纏卵腺 寧波市江北區路林市場,清理后除去外層薄膜置于-20 ℃冰箱保存備用;30%的丙烯酰胺、1.5 mol/L的Tris-HCl、1 mol/L的Tris-HCl、10% SDS、10%過硫酸銨、TEMED試劑、Schiff試劑 Solarbio公司;乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸、葡萄糖、蒽酮、牛血清蛋白、DEAE-52、考馬斯亮藍R-250、磷酸、PBS(pH7.4)、鹽酸、高碘酸、偏重亞硫酸鈉、三氯乙酸等 均為分析純。

GL21MC型冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;UV-3300型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;DNP-9162型電熱恒溫培養箱 寧波江南儀器廠;HD-A層析系統(泵、紫外檢測器、記錄儀、收集器、控制器) 上海滬西分析儀器廠有限公司;DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠;KYC-100B空氣恒溫搖床 寧波江南儀器廠;MD44透析袋(截留分子量8000～14000 Da) 北京索萊寶科技有限公司;DY89-Ⅱ型勻漿機 寧波新芝儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 取2 g墨魚纏卵腺,去外層薄膜,洗凈加一定量的NaOH溶液8000 r/min勻漿2 min,超聲波控溫反應一定時間后離心10000 r/min 15 min,取上清,2倍無水乙醇醇沉4 h,放入透析袋中透析48 h,冷凍干燥機中-60 ℃(下同)凍干得粗品。

1.2.2 單因素實驗 以粗糖蛋白得率為指標,選定NaOH濃度、提取溫度、提取時間、料液比、超聲波功率為單因素,設定基本條件為NaOH濃度0.3 mol/L、提取溫度25 ℃、提取時間2 h、料液比1∶20 g/mL、超聲波功率180 W,改變其中一個條件,其它條件保持不變,分別考察NaOH濃度(0.1、0.3、0.5、0.8、1.2 mol/L)、提取溫度(4、15、25、35、45 ℃)、提取時間(0.5、1、2、3、4、5 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL)和超聲波功率(40、80、120、160、200 W)等因素對墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響,每項實驗設置3個平行,結果取平均值。

1.2.3 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上,以NaOH濃度、提取溫度、提取時間三個因素為因子,粗糖蛋白得率為響應值,設計響應面實驗。每組實驗進行三次,結果取平均。響應面試驗設計因素表見表1。

表1 Box-Benhnken響應面試驗設計因素水平表Table 1 Box-Benhnken experimental factor level table

1.2.4 粗糖蛋白得率的測定

得率(%)=(粗糖蛋白凍干質量/干物料質量)×100

1.2.5 糖蛋白純化

1.2.5.1 DEAE-52陰離子交換柱層析 運用HD-A層析系統將響應面優化條件下制備的粗糖蛋白按1∶50的比例溶解在緩沖液中(pH7.4的PBS),微膜過濾(孔徑0.1～1 μm),過DEAE-52陰離子交換柱,用NaCl梯度洗脫(濃度范圍0～1 mol/L),洗脫速度為1 mL/min,每隔1 min記錄蛋白280 nm下的吸光度值,收集每個蛋白峰的流出液,再用硫酸蒽酮法測糖含量,收集既有糖又有蛋白的峰,凍干得糖蛋白半純品[19]。

1.2.5.2 Ssphacyl S-300HR柱層析 運用HD-A層析系統將糖蛋白半純品按1∶50的比例溶解在pH7.4的PBS緩沖液中,0.1～1 μm微膜過濾,再用該緩沖液洗脫,洗脫速度為0.5 mL/min,每隔1 min記錄蛋白吸光度值,收集每個蛋白峰流出液,分別檢測糖含量,收集既有蛋白又有糖的峰,蒸餾水透析24 h,凍干得糖蛋白純品[5]。

1.2.5.3 SDS-PAGE電泳 電泳樣品預處理:取10 mL濃度為1 g/100 mL的糖蛋白樣品,加入2 μL電泳緩沖液。10%分離膠、5%濃縮膠、80 V起始電壓,待樣品進入分離膠后電壓升至100 V,同一塊膠進行蛋白質考馬斯亮藍R-250染色,PAS糖染色[19],觀察電泳條帶。

1.2.6 墨魚纏卵腺純化物基本成分含量測定 總糖含量測定:采用硫酸-蒽酮法[20]測定,以葡萄糖標準液的質量濃度為橫坐標,以吸光值A為縱坐標作圖,線性回歸分析得標準曲線為:y=0.0047x-0.0038,R2=0.9997,按照標準曲線計算糖含量,計算公式如下:

式(1)

式(1)中:y-墨魚纏卵腺中總糖含量,g;m-樣品溶液中總糖含量,g;M-干物料質量,g。

蛋白含量測定:采用考馬斯亮藍R-250法[21],以牛血清清蛋白的質量濃度為橫坐標,以吸光值A為縱坐標作圖,線性回歸分析得標準曲線為:y(%)=0.0061x+0.0056,R2=0.9996,按照標準曲線計算蛋白含量,計算公式如下:

式(2)

式(2)中:y-墨魚纏卵腺中蛋白含量,g;m-樣品溶液中蛋白含量,g;M-干物料質量,g。

脂類測定:參照GB/T 14772-2008進行[22];水分測定:采用水分測定儀;灰分測定:采用馬弗爐灼燒法[5]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素實驗條件的確立

2.1.1 NaOH濃度對墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由1圖可知,隨著NaOH濃度的增大,得率呈現先增后減的趨勢,當NaOH濃度達到0.4 mol/L時,糖蛋白得率達到最大值11.22%,NaOH濃度超過0.4 mol/L時蛋白含量,糖蛋白得率明顯下降,可能是因為NaOH濃度過高破壞了糖蛋白的結構,導致糖和蛋白的結合斷裂,使得得率直線下降[17],因此選擇最佳NaOH濃度為0.4 mol/L。

圖1 NaOH濃度對墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.1 Effects of NaOH concentration on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.2 提取溫度對墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由2圖可知,糖蛋白得率隨著溫度的升高,呈現先增后減的趨勢,在25 ℃時達到最大值10.33%,當溫度低于25 ℃時,可能由于在低溫條件下糖蛋白在NaOH溶液中的溶出率不高,導致糖蛋白得率低,而溫度過高則導致糖蛋白糖鏈斷裂,小分子糖無法在乙醇中沉淀,影響糖蛋白得率[24],因此選擇最佳浸提溫度為25 ℃。

圖2 不同提取溫度對墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.2 Effects of different temperature on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.3 提取時間對墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由3圖可知,在浸提時間小于3 h時,糖蛋白得率隨時間的延長逐漸增大,在3～4 h之間糖蛋白得率相差不大,達到9%左右,但當浸提時間繼續延長，得率開始降低,可能是由于浸提時間過長糖蛋白分解成小分子蛋白和糖[23],在后期純化過程中被除去,導致得率降低。因此選擇浸提時間3或4 h為最佳浸提時間。

圖3 不同提取時間對墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.3 Effects of different time on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.4 料液比對墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由圖4可知,料液比在1∶5 g/mL時,浸提液中NaOH含量相對偏低,使得糖蛋白無法充分富集,導致糖蛋白得率較低,料液比在1∶20 g/mL時,糖蛋白得率達到11.53%,再增加浸提液量,糖蛋白得率無明顯變化,并且浸提液過多時,糖蛋白不易收集。綜合考慮選擇最佳料液比1∶20 g/mL,并不繼續對料液比進行響應面優化研究。

圖4 不同料液比對墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.4 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.5 超聲功率對墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由圖5可知,糖蛋白隨著超聲功率的增大而增大,超聲波促進了糖蛋白在NaOH溶液中的溶解度,使得糖蛋白得率明顯增加,因此選擇超聲功率200 W作為糖蛋白提取的最佳超聲功率,且不對其進行響應面優化研究。

圖5 不同超聲功率對墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic power on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.2 響應面優化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝

2.2.1 響應面法試驗設計結果及方差分析

2.2.2 回歸模型方差分析 響應面試驗方案及結果見表2,采用Design-Expert 8.06對試驗結果進行多項擬合回歸,得到糖蛋白得率Y的回歸方程模型:Y=16.06-0.4A+0.37B-0.97C-0.29AB+0.17AC+0.31BC-1.36A2-0.54B2-1.67C2。該回歸方程中各項系數的絕對值表示該因素對響應值影響程度的大小,系數的正負則表示該因素對響應值影響的方向[24]。

表2 響應面結果Table 2 Experimental design and results of response surface method

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 響應面交互作用分析 利用Design-Expert V8.0.6軟件分析,得到的3D圖可直觀反映響應因素,如圖6所示。

圖6 各因素交互作用響應面圖Fig.6 Response surface graph between the various factors interaction effect

由圖6可知,提取溫度和提取時間,提取時間和NaOH濃度的交互作用呈橢圓形狀,曲面陡峭,說明提取溫度與提取時間之間交互作用和提取時間與NaOH濃度的交互作用對糖蛋白得率影響較強,而提取溫度與NaOH濃度之間的交互作用等高線較疏,表明提取溫度與NaOH濃度交互作用對糖蛋白得率的影響較弱[27],這與方差分析中回歸模型的顯著性檢驗結果一致,由圖6可知,響應面最高點在所選范圍內,說明糖蛋白得率存在最大值。

2.2.4 墨魚纏卵腺糖蛋白最佳提取工藝確定及驗證 利用Design Expert 8.06軟件對糖蛋白提取工藝進行優化,得到墨魚纏卵腺糖蛋白的最佳提取工藝參數為提取溫度24.01 ℃,提取時間3.66 h,NaOH濃度0.37 mol/L,料液比1∶20 g/mL,超聲功率200W,此條件下,墨魚纏卵腺糖蛋白提取得率預測值為16.2862%,結合現實條件,將實際工藝簡化為:溫度24 ℃,時間3.6 h,NaOH濃度0.4 mol/L,料液比1∶20 (g/mL),超聲功率200 W。在此條件下進行3次驗證試驗,得出墨魚纏卵腺糖蛋白實際得率為16.13%±0.16%,與預測值誤差僅為0.96%,任艷國等[7]采用緩沖液法在海蜇頭中提取糖蛋白得率為9.14%,曾婷婷等[9]采用超聲輔助鹽溶液法提取河蜆中的糖蛋白,得率僅為0.4466%,說明堿法提取糖蛋白效果較好,該模型對優化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝具有可行性。

2.3 糖蛋白純化結果

2.3.1 DEAE-52純化 將凍干的糖蛋白粗品經DEAE-52纖維素陰離子交換層析柱層析,用0～1 mol/L的NaCl洗脫，分別檢測蛋白和糖含量,得到流出曲線如圖7。

如圖7所示,經層析柱分離,每隔1 min收集流出液,用硫酸-蒽酮法在吸光度為620 nm處檢測糖含量,發現有兩組重疊峰(11～20 min,21～31 min),由于21～31 min的重疊峰中含有兩個糖峰,考慮到后期純化過程,故選擇11～20 min時的重疊峰為研究對象,經透析,冷凍干燥得糖蛋白半純品。

圖7 DEAE-52柱層析分離圖譜Fig.7 DEAE-52 column chromatography separation map

2.3.2 Sephacyl S-300 HR柱層析 將凍干的糖蛋白半純品經Sephacyl S-300 HR柱層析,用0.02 mol/L的PBS(pH7.4)緩沖液洗脫分別檢測蛋白和糖的吸光值,得到流出曲線如圖8。

圖8 Sephacyl S-300 HR柱層析分離圖譜Fig.8 Sephacyl S-300 HR column chromatography separation map

由圖8可知,經過Sephacyl S-300 HR柱層析,采用硫酸-蒽酮法在吸光度為620 nm處檢測糖的吸光值,得到一組重疊組峰,收集高峰重疊部分,經透析,凍干后得到白色糖蛋白純品。

2.3.3 SDS-PAGE電泳鑒定純化后的糖蛋白 通過蛋白染色和糖染色條帶可以發現,兩塊染色膠在同一位置顯示條帶,且都只有一個條帶,說明純化物是糖蛋白,純度達到電泳純。根據marker條帶顯示墨魚纏卵腺糖蛋白的分子量約為80 kDa。

圖9 SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE Electrophoresis注:1:電泳標準蛋白(marker);2～4:墨魚纏卵腺糖蛋白考馬斯亮藍染色條帶;5～7:墨魚纏卵腺糖蛋白PAS染色條帶。

2.3.4 墨魚纏卵腺糖蛋白各組分含量 由表4可知,墨魚纏卵腺去外層薄膜后脂類含量較少,水分、蛋白、糖含量較多,純化后得到純化物的蛋白含量為65.53%±0.8%,糖含量為31.74%±1.1%,說明提取純化過程有效。

表4 墨魚纏卵腺原料、墨魚纏卵腺糖蛋白基本成分(%)Table 4 Basic ingredients of cuttlefish egg-wrapping glands and cuttlefish egg-wrapping glands glycoprotein(%)

3 結論

本實驗利用單因素結合響應面法優化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝,采用Design-Expert軟件的中心組合設計方法設計響應面實驗。根據分析結果并結合操作實際得出墨魚纏卵腺糖蛋白最佳提取工藝為:溫度24 ℃,時間3.6 h,NaOH濃度0.4 mol/L,料液比1∶20 g/mL,超聲功率200 W。在此條件下進行驗證試驗,得出墨魚纏卵腺糖蛋白實際得率為16.13%±0.16%,與預測值誤差僅為0.96%,說明該模型對優化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝具有可行性。

對最優工藝下的提取物進行純化,經EDAE-52離子交換柱層析分離、Sephacryl S-300HR柱層析分離后得到純品糖蛋白,經電泳分析得出所純化的糖蛋白純度達到電泳純,其中蛋白含量為65.53%±0.8%,總糖含量為31.74%±1.1%,得率為墨魚纏卵腺去外層薄膜原料的0.91%。