響應面優化羊肚菌多糖提取工藝及抗氧化性

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(山西大學生命科學學院,山西太原 030006)

羊肚菌(Morchellaesculenta)是一種野生真菌。口感脆嫩,美味可口,含有人體所需的必需氨基酸,受到國內外消費者的喜愛[1]。羊肚菌藥用價值最早記錄于《本草綱目》,主要用于治療積食、咳嗽等癥狀[2]。現代研究表明,真菌多糖具有較好的生物活性[3],羊肚菌多糖更是因其具有抗疲勞[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗菌活性[7]、抑制癌細胞增殖[8]等諸多作用成為研究熱點。

目前,羊肚菌多糖的研究主要集中在菌絲體[9]與發酵液[10],對子實體研究較少。多糖提取工藝包括水提醇沉法[11]、酶法[12]、超聲波萃取法[13]、超臨界流體萃取法[14]、膜分離技術[15]等。明建[16]用水提醇沉提取羊肚菌多糖,最高得率為4.96%,用Sevag法脫蛋白,脫除次數多且多糖保留率低。Xu等[17]比較超聲波法、微波法、超聲波協同微波法三種方法對羊肚菌多糖得率的影響,超聲波協同微波法效果最好,最高得率為7.53%,且超聲波法優于微波法。晁紅娟等[18]提出生物酶具有專一性、高效性、反應溫和等優點,在毛竹提取過程中,添加纖維素酶,可以促進多糖溶出,提高得率。酶法提取羊肚菌多糖的研究還未見報道。

為提高羊肚菌多糖得率,進行抗氧化活性性質的研究,本實驗以山西省安澤縣[19]野生羊肚菌(Morchellaumbrina)子實體為原料,對常見的生物酶進行篩選,利用超聲波輔助提取多糖,通過響應面法優化提取工藝,并對初步純化后的多糖進行抗氧化能力研究,以期為羊肚菌在功能食品中的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生羊肚菌子實體 山西省安澤縣;纖維素酶(3 U/mg)、果膠酶(40 U/mg)、木瓜蛋白酶(6000 U/mg) Sigma公司;其它試劑均為分析純。

JS30-230多功能攪拌機 浙江蘇泊爾股份有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;SB-5200DT超聲波清洗儀 寧波生物科技股份有限公司;SHB-III循環水式真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;HRHS24電熱恒溫水浴鍋 青島海爾醫用低溫科技有限公司;SP-2000UV型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司;SC-3614離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 野生羊肚菌子實體多糖的提取工藝流程 羊肚菌子實體→干燥(40 ℃、6 h)→粉碎過80目篩(羊肚菌粉末)→酶解→超聲波提取→滅酶(95 ℃、15 min)→離心(4500 r/min、15 min)→取上清液→濃縮→4倍體積無水乙醇醇沉過夜[20]→離心(4500 r/min、15 min)→沉淀溶解(蒸餾水)→定容→多糖脫蛋白→多糖脫色素→粗多糖。

1.2.2 不同酶的選取 取4份1.00 g羊肚菌粉末,1、2、3組分別加入0.01 g纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶,第4組不添加酶作為對照。相同條件下提取,比較不同酶對羊肚菌多糖得率的影響。

1.2.3 羊肚菌多糖的測定

1.2.3.1 標準曲線的制備 苯酚-硫酸法[21]測定多糖含量,葡萄糖(0.1 mg/mL)作為標準品,吸光度A為橫坐標,濃度C為縱坐標,得標準曲線方程:C=0.0733A-0.0014,R2=0.9944。

1.2.3.2 樣品多糖含量的測定 提取的多糖按照1.2.3.1的方法測定吸光度,得率計算見式(1)

W(%)=(C×V×N×10-3/M)×100

式(1)

式中:W為多糖得率,%;C為多糖濃度,mg/mL;V為定容體積,mL;N為稀釋倍數;M為樣品質量,g。

1.2.4 酶解條件的優化

1.2.4.1 單因素實驗 準確稱取1.00 g羊肚菌粉末,固定酶解溫度50 ℃、超聲功率200 W、超聲溫度50 ℃,固定酶用量0.8%，酶解pH4.0,酶解時間60 min,超聲時間30 min,料液比20∶1 mL/g,考察不同羊肚菌粉末與水的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)、酶用量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、酶解pH(3.2、3.6、4.0、4.4、4.8)、酶解時間(20、40、60、80、100 min)和超聲時間(10、20、30、40、50 min)對羊肚菌多糖得率的影響。

1.2.4.2 Plackett-Burman實驗 Plackett-Burman 試驗設計在單因素實驗基礎上,以多糖得率為響應值,從多個影響因素中篩選出影響多糖得率顯著的因素[22-24]。實驗因素及水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman 實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment

1.2.4.3 響應面試驗設計 根據Plackett-Burman實驗結果,選取液料比、酶解pH、酶解時間3個因素設計響應面,對多糖提取條件進行優化。實驗因素及水平編碼如表2所示。

表2 響應面設計的因素和水平Table 2 The factors and levels of response surface design

1.2.5 羊肚菌多糖脫蛋白

1.2.5.1 蛋白含量的測定 考馬斯亮藍法測蛋白含量[23],以吸光度A為橫坐標,牛血清白蛋白濃度C為縱坐標,得標準曲線方程C=0.146A-0.0103,R2=0.9901。

1.2.5.2 脫蛋白方法選擇

a:TCA法:取一定量多糖溶液,加入等體積的TCA溶液,振蕩10 min,4 ℃下靜置30 min,4500 r/min離心15 min,測定上清液蛋白含量、多糖含量。

b:酶法:取一定量多糖溶液,加入2%木瓜蛋白酶,50 ℃酶解30 min,滅酶,冷卻,4500 r/min離心15 min,取上清液測定蛋白含量、多糖含量。

c:酶+TCA法:酶法脫蛋白后取上清液,再通過TCA法脫蛋白,取上清液測定蛋白含量、多糖含量。

式(2)

蛋白脫除率(%)=(脫蛋白前蛋白含量-脫蛋白后蛋白含量)×100/脫蛋白前蛋白含量

式(3)

1.2.6 羊肚菌多糖脫色方法的確定

1.2.6.1 脫色過程指標檢測 多糖溶液脫色前為橙黃色,根據互補色原理[24],選擇450 nm波長處測定吸光度。

1.2.6.2 脫色方法選擇

a:H2O2法:參考文獻[25]并有所改進:取10 mL多糖溶液,用氨水調節pH7.0,加入0.5 mL 30% H2O2溶液,45 ℃下脫色至顏色不變,測定吸光度,計算脫色率、多糖保留率。

b:活性炭法:取10 mL多糖溶液,加入1 g活性炭,恒溫振蕩2 h,過濾,取濾液測定吸光度,計算脫色率、多糖保留率。

c:AB-8大孔吸附樹脂法[26]:選用靜態吸附法,將10 g預處理樹脂放入200 ml的三角瓶,加10 mL多糖溶液,恒溫振蕩2 h,振蕩結束后,取濾液測定吸光度,計算脫色率、多糖保留率。

脫色率(%)=(脫色前吸光度值-脫色后吸光度值)×100/脫色前吸光度值

式(4)

式(5)

1.2.7 抗氧化能力的測定 分別選擇由0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的羊肚菌多糖及VC進行抗氧化實驗。

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力 參考Ma等[27]的方法并加以改動,吸取2 mL多糖溶液,加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,混勻,暗處反應30 min,517 nm處測定吸光度。對照組用無水乙醇代替DPPH,空白組用蒸餾水代替多糖溶液。VC作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算見公式(6)。

式(6)

1.2.7.2 羥自由基清除能力 向試管中加入1.00 mL 9 mmol/L FeSO4、1.00 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液,分別加入1 mL多糖溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2,在室溫下反應30 min,510 nm波長處測定其吸光度,對照組用蒸餾水代替水楊酸,空白組用蒸餾組代替多糖溶液[28]。VC作為陽性對照。羥自由基清除率計算見公式(7)。

式(7)

式(8)

1.3 數據統計分析

采用Excel 作圖，Minitab 17軟件設計Plackett-Burman實驗,利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及優化分析。

2 結果與分析

2.1 不同酶處理羊肚菌多糖得率

由圖1可知,同等提取條件下,加酶可以提高多糖得率,纖維素酶組多糖得率為6.85%,這是因為纖維素酶可以有效地破壞細胞壁[30],使多糖溶出。果膠酶組、木瓜蛋白酶組比空白組高,但得率低于纖維素酶組,所以本實驗選用纖維素酶酶解。

圖1 不同酶對羊肚菌多糖得率的影響Fig.1 Effects of the different enzymes on the yield of polysaccharides

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 液料比對多糖得率的影響 如圖2所示,多糖得率隨著液料比的增加而先增加后降低。液料比為20∶1 mL/g時,多糖得率最高。這可能是因為液料比較小時,多糖與其它物質結合緊密,不能充分溶出[31];液料比超過20∶1 mL/g,多糖得率降低,這可能是大量的提取劑不利于提取體系的傳熱和傳質[32]。因此選擇20∶1 mL/g為最佳液料比。

圖2 液料比對羊肚菌多糖得率的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on yield of polysaccharides

2.2.2 酶用量對多糖得率的影響 如圖3所示,當酶用量從0.2%增至0.8%時,多糖得率增加。酶用量達到0.8%時,多糖得率為4.82%,這可能是因為增大酶濃度增加,酶與底物充分接觸,溶解出大量多糖。酶用量大于0.8%,多糖得率有所下降,可能是多糖發生降解[33]。綜合考慮,酶用量應選擇0.8%。

圖3 酶用量對羊肚菌多糖得率的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage on yield of polysaccharides

2.2.3 酶解時間對多糖得率的影響 酶解時間是影響多糖得率的重要因素,如圖4所示,隨酶解時間的增加,多糖得率先增加后降低。酶解時間太短,酶與底物不能充分反應,多糖溶出少,而酶解時間過長可能會導致多糖結構被破壞,多糖得率降低。因此選擇60 min為最佳酶解時間。

圖4 酶解時間對羊肚菌多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield of polysaccharides

2.2.4 酶解pH對多糖得率的影響 由于不同的酶有不同的最適pH范圍,調節提取液pH會影響酶的活性[34]。如圖5所示,多糖得率隨pH的增加先升高后下降,pH為4.0時,多糖得率達到最大值6.74%。在pH3.6～4.4范圍內纖維素酶具有較強的活力,可加速羊肚菌細胞壁中纖維素的降解,使多糖溶出、得率增加。因此選擇4.0為最適酶解pH。

圖5 酶解pH對羊肚菌多糖得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on yield of polysaccharides

2.2.5 超聲時間對多糖得率的影響 如圖6所示,超聲時間小于20 min,羊肚菌多糖得率隨著超聲時間的延長而增加。超聲時間大于20 min 時,多糖得率下降。超聲波處理時間與多糖提取過程密切相關,處理時間短,多糖不能充分溶出;時間太長,導致多糖降解[35]。因此,選擇20 min為最佳超聲時間。

圖6 超聲時間對羊肚菌多糖得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharides

2.3 Plackett-Burman試驗

本實驗選用n=12的PB試驗設計模塊,對液料比(X1)、酶用量(X2)、酶解時間(X3)、酶解pH(X4)、超聲時間(X5)5個因素進行評價,實驗設計及結果見表3,顯著性檢驗結果見表4。由表4可見,酶解pH、超聲時間兩個因素影響顯著(p<0.05),料液比影響極顯著(p<0.01),故選取影響大的三個因素進行響應面優化,酶用量與酶解時間選取單因素實驗最優水平,即酶用量0.8%、酶解時間60 min。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Plackett-Burman experimental design and the results

表4 Plackett-Burman試驗統計分析Table 4 Statistical analysis of the Plaekett-Burman experimental results

2.4 響應面優化提取羊肚菌多糖工藝

2.4.1 Box-Behnken試驗設計及結果 根據單因素和PB試驗結果,選取液料比(A)、酶解pH(B)和超聲時間(C)為自變量,以多糖得率(Y)為響應值,利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計,試驗設計方案及結果見表5。

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of response surface

2.4.2 回歸模型的建立及方差分析 對表5試驗結果進行多元回歸擬合,得二次多項式回歸模型:Y(%)=7.71+0.43A+0.079B-0.46C-0.29AB-0.45AC-0.26BC-0.63A2-1.03B2-1.97C2。回歸模型方差分析結果見表6。回歸模型極顯著(p<0.01),失擬項不顯著(p>0.05);回歸方程總決定系數R2=0.9746,表明該模型對實驗擬合度較好,可用該模型對實驗結果進行預測。影響得率的主次因素為超聲時間>液料比>酶解pH。

表6 回歸模型的方差分析及回歸系數的顯著性檢驗Table 6 Variance analysis of regression model and significance test of regression coefficient

2.4.3 響應面的曲面分析 圖7直觀地給出了各因素交互作用的響應面分析圖和等高線分析圖。響應面的坡度越大說明該因素對多糖得率影響越強,橢圓形的等高線圖說明兩因素之間交互作用顯著,圓形說明交互作用不顯著[36]。由圖7可以看出在實驗因素水平范圍內,存在羊肚菌多糖的最大得率。由圖7a可知,酶解pH3.6～4.4、液料比15∶1～25∶1 mL/g范圍內,多糖得率先增大后減小。pH4.0、液料比20∶1 mL/g附近值對羊肚菌多糖得率有重要影響。由圖7b可以看出,液料比15∶1～25∶1 mL/g、超聲時間10～30 min,多糖得率先增大后減小。由圖7c可得,酶解pH3.6～4.4、超聲時間10～30 min時,多糖得率先增大后減小,pH4.0、超聲時間20 min附近值多糖得率最大。

圖7 各因素對羊肚菌多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effects of cross interactions among factors on extraction rate of polysaccharides注:a:液料比與酶解pH;b:液料比與超聲時間;c:超聲時間與酶解pH。

2.4.4 確定最優工藝和回歸模型的驗證實驗 通過對回歸模型的分析,可以確定羊肚菌多糖提取的最佳條件為:液料比21.84∶1 mL/g、酶解pH3.97、超聲時間18.96 min、此時羊肚菌多糖得率為7.83%。為方便操作,將羊肚菌多糖的提取條件修正為:液料比22∶1 mL/g、酶解pH4.0、超聲時間19 min。經實驗驗證,羊肚菌多糖得率為7.79%,該工藝優化效果顯著。

2.5 羊肚菌多糖脫蛋白結果

從圖8可以看出,TCA法蛋白脫除率為77.27%,多糖保留率為72.62%;雖然酶法脫蛋白,多糖保留率高,但蛋白脫除率低;而TCA法+酶法蛋白脫除率高,多糖保留率低于TCA法[37]。綜合考慮,選用TCA法脫蛋白。

圖8 脫蛋白方法對多糖的影響Fig.8 Effects of deproteinization methods on protein removal rate and polysaccharides retention rate

2.6 羊肚菌多糖脫色結果

圖9可以看出,活性炭脫色率最低,且雜質不易去除;H2O2法脫色率雖高于活性炭法,但由于其強氧化性,使多糖結構遭到破壞,使多糖保留率最低。AB-8大孔樹脂吸附法脫色率84.25%,多糖保留率為95.71%,且不會破壞多糖的生物活性[38]。因此,選用AB-8大孔樹脂吸附法對多糖溶液脫色。

圖9 脫色方法對多糖的影響Fig.9 Effects of decolorization methods on decoloraization rate and polysaccharides retention rate

2.7 羊肚菌多糖的抗氧化活性

2.7.1 DPPH自由基清除能力測定結果 從圖10可知,羊肚菌多糖和VC清除DPPH自由基的能力隨濃度的增加而增強。濃度從0.2 mg/mL增加到1.0 mg/mL,DPPH自由基的清除率從14.61%增加至60.67%;VC的清除率從65.06%增加至94.23%。付立紅等[39]從羊肚菌發酵液中提取多糖,當質量濃度為1.30 mg/mL時,對DPPH自由基的清除率為53.22%。綜上表明,羊肚菌多糖可以有效地清除DPPH自由基,但效果低于VC。

圖10 羊肚菌多糖和VC對DPPH自由基的清除能力Fig.10 DPPH free radical scavenging abilities of Morchella esculenta polysaccharides and VC

2.7.2 羥自由基清除能力測定結果 由圖11可知,在0～1 mg/mL濃度范圍內,羊肚菌多糖與VC對羥自由基的清除能力呈上升趨勢,質量濃度為0.2 mg/mL,羊肚菌多糖與VC對羥自由基的清除率分別為34.29%、57.61%;當質量濃度達到1 mg/mL 時,對羥自由基的清除能力分別為70.77%、93.76%。黃俊麗等[40]從松茸里提取多糖,質量濃度為1 mg/mL 時,對羥自由基的清除率僅為59.00%。結果表明,羊肚菌多糖清除羥自由基的能力良好。

圖11 羊肚菌多糖和VC對羥自由基的清除能力Fig.11 Hydroxyl free radical scavenging abilities of Morchella esculenta polysaccharides and VC

2.7.3 超氧陰離子自由基清除能力結果 超氧陰離子自由基是弱氧化劑,本身對身體無害。但是它與羥基分子結合可能會破壞DNA和其他生物分子[41]。由圖12可知,羊肚菌多糖與VC對超氧陰離子的清除速度呈現先增加后趨于穩定趨勢,濃度在0～0.6 mg/mL的范圍內,清除速率變化較快,當濃度大于0.6 mg/mL時,清除率變化緩慢。當濃度為1 mg/mL時,羊肚菌多糖對超氧陰離子的清除率為72.76%。結果表明羊肚菌多糖具有顯著的超氧陰離子自由基清除活性(p<0.05)。

圖12 羊肚菌多糖和VC對超氧陰離子的清除能力Fig.12 Superoxide radical scavenging abilities of Morchella esculenta polysaccharides and VC

3 結論

通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗設計以及響應面實驗,確定野生羊肚菌子實體多糖提取的最佳工藝參數:液料比22∶1 (mL/g)、酶解pH4.0、酶解時間60 min、超聲時間19 min、酶用量0.8%,在此條件下多糖平均得率為7.79%,優化結果比傳統熱水提取法最佳條件下多糖得率提高了57%,提取時間縮短2/3[16]。采用TCA法可以有效的去除羊肚菌粗多糖中的蛋白質,并保持較高的多糖保留率;AB-8大孔樹脂吸附法脫除多糖色素,效果顯著,且不會破壞多糖結構[42],是脫色素的有效方法。抗氧化實驗結果表明,羊肚菌多糖對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基均有良好的清除作用。羊肚菌多糖是一種具有利用價值與開發前途的保健品,本實驗為羊肚菌子實體的進一步研究利用提供理論依據。