近紅外光譜法快速測定榨菜中亞硝酸鹽含量

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(長沙理工大學化學與生物工程學院,湖南長沙 410114)

蔬菜在生長過程中會從土壤及氮肥中獲得硝酸鹽類物質,在蔬菜進一步加工處理過程中,硝酸鹽類物質會被還原成亞硝酸鹽,同時,亞硝酸鹽由于具有發色、抑菌抗氧化作用被作為食品添加劑廣泛用在食品領域[1]。但亞硝酸鹽與血紅蛋白結合,使紅血球運輸氧的能力減弱,對人體造成危害。在酸性條件下,亞硝酸鹽可以與蛋白質中的胺類結合生成強致癌物質亞硝酰胺,嚴重威脅人類生命健康[2]。我國國家標準明確規定醬腌菜中亞硝酸鹽含量不得超過20 mg/kg[3]。亞硝酸鹽是國家和地方標準所規定的在食品行業中要嚴格控制殘留量的化學物質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榨菜 購自商場,12個品牌5～7個批次共60個不同樣品;亞鐵氰化鉀溶液 廣東光華科技股份有限公司,106 g/L;乙酸鋅溶液 上海展云化工有限公司,220 g/L;飽和硼砂溶液 廣東光華科技股份有限公司,50 g/L;對氨基苯磺酸溶液 天津市凱通化學試劑有限公司,4 g/L;鹽酸萘乙二胺溶液 天津市致遠化學試劑有限公司,2 g/L;亞硝酸鈉標準溶液 廣東光華科技股份有限公司,200 μg/mL;亞硝酸鈉標準使用液 廣東光華科技股份有限公司,50 μg/mL;鹽酸 天津市凱通化學試劑有限公司,0.42 mol/L；所用試劑均為分析純。

GL323-1SCN型分析天平 賽多利斯公司 HH-M2型恒溫水浴鍋 上海赫田科學儀器有限公司 FK-A型組織搗碎機 國盛公司 TY-727型分光光度計 金義博儀器科技有限公司 Antaris Ⅱ型傅立葉近紅外光譜分析儀 Thermo Nicolet公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品化學值測定 依照國家標準文獻GB500933-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[11]中的第二種方法分光光度法,市售榨菜樣品經粉碎研磨后過篩(50目),將經過化學反應的樣品溶液于538 nm波長處測量對應的吸光度,繪制標準曲線,最后確定樣品中亞硝酸鈉殘留量[9]。

計算公式:

式中:m1-樣品中亞硝酸鈉質量(μg)；1000-轉換系數；m2-試樣質量(g)；v1-測定用樣液體積(mL)；v0-試樣處理液總體積(mL)。

1.2.2 樣品光譜采集 將60 g榨菜樣品放入攪拌機中攪碎,加入200 mL去離子水混合均勻后過濾,所得濾液加入亞硝酸鈉,制成亞硝酸鈉含量為0.122～39.0875 mg/kg,濃度梯度為0.66 mg/kg的60個樣本,將樣本裝入液體透射試劑管中,待傅立葉變換近紅外光譜儀預熱1 h后,采用液體透射采集工作流,智能投射附件樣品類型采集近紅外光譜,掃描波數范圍:開始4000 cm-1;結束10000 cm-1,經液體透射&平均譜工作流優化:分辨率8.0 cm-1,每張光譜累積掃描次數64次,增益為4×,每個樣品掃描3次,取平均光譜作為樣品光譜,環境溫度25 ℃,濕度46%,內置背景為參考。

1.2.3 光譜數據處理 采用Antaris Ⅱ型傅立葉近紅外光譜分析儀以及TQ Analyst軟件,將采用國標法測得的實際數值與采集到的近紅外樣品光譜相關聯,對比偏最小二乘法(PLS)和主成分分析(PCR)兩種光譜處理分析方法,利用馬氏距離法除去相近和異常樣品數據,從而建立最佳數據光譜模型[12]。

1.2.4 模型預測能力評估 模型相關系數(r)、內部交叉驗證均方根誤差(RMSECV)和外部預測均方根誤差(RMSEP)的數值大小可以反應TQ analyst 9軟件所建立光譜模型的預測性能。其中模型相關系數(r)越接近1,RMSECV,RMSEP越小,模型的預測性能越好[13]。計算方法如(3)～(5)所示[10]:

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式(5)

其中,本實驗取樣品總數70個,校正集60個,驗證集10個。

1.3 數據統計分析

實驗數據采用TQ analyst軟件進行模型建立,選取最佳模型得出模型預測值,與實際測量值利用EXCEL(Microsoft)進行F檢驗與等方差t檢驗。

2 結果與分析

2.1 國標法檢測樣品中亞硝酸鈉

由1.2.1方法測得樣品吸光值為0.122,代入圖1標準曲線公式:y=0.2178x+0.0539得到x=0.3127 μg,由公式:

圖1 國標法測量亞硝酸鈉含量標準曲線圖Fig.1 Standard curve of sodium nitrite measured by national standard method

2.2 榨菜樣品近紅外原始透射光譜常規分析及建模波段選擇

圖2 亞硝酸鈉濃度對水近紅外光譜的影響Fig.2 Effects of sodium nitrite concentration on water near-infrared spectroscopy

圖3 榨菜樣品近紅外原始透射光譜圖Fig.3 Raw near infrared transmission spectra of the sample of pickled mustard

圖4 榨菜種亞硝酸鈉經一階微分和平滑預處理的近紅外光譜透射曲線Fig.4 Near-infrared spectral transmission curves of sodium nitrite by first-order differential and smooth pretreatment

圖5 榨菜樣品中亞硝酸鹽近紅外平均光譜Fig.5 Near infrared mean spectrum of nitrite in the sample of pickled mustard

2.3 最佳主因子數

主成分因子數影響模型的預測能力。交叉驗證方根誤差(RMSECV)會隨主成分因子數改變而改變,由圖6可知,RMSECV先隨著主成分數的增大而減小,當主成分因子數為6時對應的RMSECV最小,隨后隨著主成分數的增大而增大。RMSECV最小值所對應的主成分因子數即為光譜模型的最佳主因子數[19]。若選取的主成分數過少,即模型的主因子數過小,會丟失原始光譜中較多有用信息,擬合不充分;若選取的主成分數過多,即模型的主因子數過大,則會出現過擬合現象[20];當主因子數大于8時,會大大增加過擬合現象的可能性,本實驗采取的交互驗證方法選取的最佳主成分因子數為6,此時模型效果最佳。

圖6 基于全光譜的PLS模型最佳主成分數Fig.6 Optimal main fraction of PLS model based on full spectrum

2.4 光譜處理比較

如圖7～圖11分別顯示出利用偏最小二乘法(PLS)比較無預處理、一階微分處理(1D)、二階微分處理(2D)與Savitzky-Golay filter 濾波平滑互相組合后的光譜建模效果,經TQ analyst 9軟件計算,結果顯示一階微分(1D)與Savitzky-Golay filter 濾波平滑組合對光譜進行預處理后的主成分數為6,是上述最佳主成分數,且內部交叉驗正均方差(RSMEC)、外部預測均方根誤差(RMSEP)值分別為0.0310、0.0141最接近于0,Rc、RP值分別為0.9720,0.9925接近于1,建模效果最優,其中無預處理的PCR亞硝酸鈉模型Rc、RP值分別為0.9833,0.9937雖然相比較于經一階微分(1D)、Savitzky-Golay filter 濾波平滑組合的光譜預處理后的亞硝酸鈉光譜模型Rc、RP值更接近于1,但由于其主因子數為10,主成分數過大,會出現過擬合現象[21],大大降低模型的穩定性和預測能力,故不為最優建模選擇。如圖12～圖16分別為利用主成分回歸法(PCR)比較無預處理、一階微分處理(1D)、二階微分處理(2D)、Savitzky-Golay filter 濾波平滑互相組合后的建模效果,如表3從五種數據比較分析,整體比較PLS方法RSMEC,RMSEP較大,Rc、RP較小,故PCR建模效果較PLS稍差,故本實驗采用一階微分(1D)、Savitzky-Golay filter 濾波平滑組合的方式建立光譜模型。榨菜樣品模型中亞硝酸鹽近紅外光譜建模主要參數及評價指標如表4。

表1 兩種建模方法在不同預處理下的數據比較Table 1 Data comparison of two modeling methods under different preprocessing

表2 榨菜中亞硝酸鹽含量預測值與實測值比較Table 2 Comparison between the predicted and measured values of nitrite content in pickled mustard

表3 F-檢驗雙樣本方差分析Table 3 F-test two-sample analysis of variance

表4 T-檢驗雙樣本等方差假設Table 4 T-test two-sample equal variance hypothesis

圖7 PLS模型的校正集和預測集無預處理預測值與實測值的關系Fig.7 Relationship between the correction set and the prediction set of the PLS model without preprocessing and the true value

圖8 PLS模型的校正集和預測集經一階微分處理后預測值與實測值的關系Fig.8 Relation between the predicted value and the true value after the first order differential treatment of the correction set and the prediction set of the PLS model

圖9 PLS模型的校正集和預測集經一階微分處理+Savitzky-Golay filter濾波平滑后預測值與實測值的關系Fig.9 Relation between the corrected set and the prediction set of the PLS model after the first order differential processing of the +Savitzky-Golay filter smoothing the prediction value and the true value

圖10 PLS模型的校正集和預測集經二階微分處理后預測值與實測值的關系Fig.10 Relation between the predicted value and the true value of the correction set and the predictive set of the PLS model after the two order differential treatment

圖11 PLS模型的校正集和預測集經二階微分處理 +Savitzky-Golay filter濾波平滑后預測值與實測值的關系Fig.11 Relationship between the predicted set and the predictive set of the PLS model after the two order differential processing+Savitzky-Golay filter filter smoothing the prediction value and the true value

圖12 PCR模型的校正集和預測集無預處理預測值與實測值的關系Fig.12 Relationship between the correction set and the prediction set of the PCR model without preprocessing and the true value

圖13 PCR模型的校正集和預測集經一階微分處理后預測值與實測值的關系Fig.13 Relation between the predicted value and the true value after the first order differential treatment of the correction set and the prediction set of the PCR model

圖14 PCR模型的校正集和預測集經一階微分處理+Savitzky-Golay filter濾波平滑后預測值與實測值的關系Fig.14 Relation between the corrected set and the prediction set of the PCR model after the first order differential processing of the+Savitzky-Golay filter smoothing the prediction value and the true value

圖15 PCR模型的校正集和預測集經二階微分處理后預測值與實測值的關系Fig.15 Relation between the predicted value and the true value of the correction set and the predictive set of the PCR model after the two order differential treatment

圖16 PCR模型的校正集和預測集經二階微分處理+ Savitzky-Golay filter濾波平滑后預測值與實測值的關系Fig.16 Relationship between the predicted set and the predictive set of the PCR model after the two order differential processing+Savitzky-Golay filter smoothing the prediction value and the true value

2.5 近紅外光譜預測值與國標法測得實際值比較

建立近紅外優選模型后,將未參與建模的10個預測樣組成的預測集代入模型進行預測,同時與國標法測得的實際值進行比較,驗證優選模型的準確性,其中每個預測樣品掃描3次,取平均光譜作預測光譜,環境溫度25 ℃。國標法測定的實際值測兩次取平均值,對比結果見表5。

為檢驗所建模型的預測能力,對兩組數據進行F檢驗。偏最小二乘法(PLS)是通過建立光譜數據與亞硝酸鈉濃度分類值之間的多元統計回歸模型,對于二元以上的多元回歸模型[22],解釋變量的整體對被解釋變量的影響是顯著的,并不表明每一個解釋變量對它的影響都顯著。因此在做完F檢驗后還須進行t檢驗[23]。

如表3所示,F檢驗結果1.349245>1,為右側檢驗,F<“F單尾臨界”,P(F≤f)單尾=0.33133>0.05,兩組數據(化學實測值,模型預測值)精密度無顯著差異。根據方差檢驗結果,檢驗平均值時采用等方差t檢驗由于|t|<“t雙尾臨界”,“P(T<=t)雙尾”>0.05,所以兩平均值之間無顯著差異[24]。分析上表中各列標準差小于3,表明大部分數值與平均值差異較小,即離散度較小,模型較穩定且準確性較好[25],根據上表的化學實測值,模型預測值,計算光譜模型相關系數R=0.9378相關系數較高說明模型預測能力較好。

3 結論

實驗結果表明經一階微分、Savitzky-Golay filter濾波平滑(17點2次)和偏最小二乘法(PLC)組合建模效果最優,內部交叉驗正均方差(RSMECV)、外部預測均方根誤差(RMSEP)、交叉驗證決定系數(Rc)、預測決定系數(Rp)依次為:0.0310、0.0141、0.9720、0.9925,國標法測量亞硝酸鹽的實測值與近紅外定標模型預測值之間的Rc=0.9720>0.96,RMSECV與 RMSEP數值均小于0.1,說明FNIR光譜數學模型的預測值與國家標準法的實際測量值有高度的相關性,將近紅外樣本預測集與國標法實測數據進行對比,根據F檢驗與T檢驗的結果表明兩種數據測量結果無顯著性差異,即本實驗的FNIR數學模型能夠預測榨菜中亞硝酸鹽的含量。