熒光光譜法測定淀粉中的直鏈淀粉

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(忻州師范學院化學系,山西忻州 034000)

天然淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉兩大主要成份組成,直鏈淀粉與支鏈淀粉在不同來源的淀粉中的含量不同。大多數植物的淀粉中直鏈淀粉含量為10%～12%,但有一些植物的淀粉中直鏈淀粉含量較高。如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉中直鏈淀粉的含量分別為27%和20%[1]。直鏈淀粉用途廣泛,涉及食品、醫療保健、材料、紡織、造紙、包裝、環保等多個領域,可用作食品添加劑、增厚劑、固定劑和包衣劑,還可用于制作對氧和油脂具有良好隔絕性的產品保護層等[2]。由于直鏈淀粉具有優越的性能和廣泛的應用前景,且其含量在評價糧食和食品品質及農業選種、育種中具有重要意義,因此選擇一種準確、有效、簡便的測定直鏈淀粉含量的測定方法具有重要的實際意義[3]。

測定直鏈淀粉含量的標準方法是碘比色法[4],它包括國家標準、國際標準和農業部標準,這些標準方法的測定,前處理復雜,技術性強,步驟繁瑣,應用受到很大限制;目前常用的直鏈淀粉含量的測試方法是碘親和力滴定法[5]和雙波長法[6]。碘親和力滴定法有電位滴定法和電流滴定法,借助于電位和電流的變化,使得該法快速、簡便,能進行大批量樣品的檢測。但由于支鏈淀粉也會與碘形成絡合物,因此,測定有一定的誤差,雙波長法克服了上述缺點,提高了靈敏度和選擇性。也曾有采用伴刀豆球蛋白法[7]和排阻色譜分析法[8]測定直鏈淀粉含量的報道,這兩種方法雖然測定結果準確,但伴刀豆球蛋白法要求在指定的pH、溫度和離子強度下測定,原理復雜,使用酶試劑;排阻色譜分析法淋洗時間長,色譜柱的要求高,而且需要將直鏈淀粉從被測樣品中分離。最新發展的直鏈淀粉含量測定的方法有近紅外光譜分析法[9]、自動分析檢測法[10],近紅外光譜分析法方便、樣品用量小,不消耗化學試劑,不污染環境。但它的準確性與定標模型建立的質量和合理使用模型有很大關系,收集模型樣品人力、物力耗費大,而且不能用于直鏈淀粉含量的精確測定和食品材料的評價。自動分析檢測法原理與碘比色法一樣,用儀器代替了人工,提高了工作效率,但需經常更換塑膠藥管等零配件。

Charoenkuln等[11]報道了采用熒光標記和高效排阻色譜法同時測定木薯直鏈淀粉含量和支鏈淀粉鏈長的方法,這種方法雖然測定結果準確,但測定過程既需分離直鏈淀粉,又需進行熒光標記反應,不僅測定步驟繁瑣,而且測定條件苛刻。因此,對直鏈淀粉含量的測試迫切需要一種簡便、快速、準確的方法。本實驗探究了利用直鏈淀粉自身產生的熒光信號,不加顯色劑,不加熒光標記物,不需要分離,快速、準確的測定淀粉中直鏈淀粉含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

直鏈淀粉標準品 天津市光復精細化工研究所;支鏈淀粉標準品 梯希愛化成工業發展有限公司;玉米淀粉、土豆淀粉 食品級,忻州華美超市。

F-4500熒光分光光度計 日本日立公司;pHS-3TC精密數顯酸度計 上海天達儀器有限公司;AB204-N電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取10 g過100目篩的玉米淀粉和土豆淀粉,用石油醚脫脂3次,在恒溫干燥箱中于120 ℃恒溫干燥3 h,待用。

1.2.2 溶液的配制 標準品溶液的配制:準確稱取一定量的支鏈淀粉和直鏈淀粉標準品,用二次蒸餾水分別配制1.0 mg/mL、1.0 μg/mL的支鏈淀粉、直鏈淀粉標準品水溶液。

標準曲線溶液的配制:用1.0 μg/mL的直鏈淀粉標準品水溶液1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL分別于7個10 mL比色管中,用二次水稀釋到刻度,得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μg/mL的直鏈淀粉標準品水溶液。

玉米淀粉、土豆淀粉溶液配制:稱取處理好的玉米淀粉樣品、土豆淀粉樣品,配制1.0 mg/mL和1.0 μg/mL的玉米淀粉和土豆淀粉溶液。

1.2.3 激發波長與發射波長的測定 在2支10 mL比色管中,加入4.0 mL濃度為1.0 μg/mL的直鏈淀粉標準品溶液,用二次蒸餾水定容至刻度,搖勻。在狹縫寬度為5 nm，在300～480 nm范圍內熒光掃描,確定其最大激發波長和發射波長。

1.2.4 放置時間對熒光強度的影響 分別移取濃度為0.4 μg/mL直鏈淀粉水溶液于10 mL比色管中,在狹縫寬度為5 nm、激發波長為370 nm條件下,分別測定溶液放置時間為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h的熒光強度。

1.2.5 溫度對熒光強度的影響 取10份0.4 μg/mL直鏈淀粉水溶液于10 mL比色管中,在狹縫寬度為5 nm,激發波長為370 nm條件下,分別測定溫度為20、24、28、32、36、40、44、48、52、56 ℃的熒光強度。

1.2.6 干擾試驗 分別準確移取0.4 mL濃度為1.0 mg/mL的直鏈淀粉標準品水溶液于6個1000 mL容量瓶中,然后分別加入4.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 mL濃度為1.0 mg/mL的支鏈淀粉標準品水溶液,得到含有0.4 μg/mL直鏈淀粉標準品和4.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0 μg/mL支鏈淀粉標準品混合溶液中(即混合溶液中直鏈淀粉與支鏈淀粉濃度比為1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100)。在狹縫寬度為5 nm、激發波長為370 nm條件下,分別測定六個混合溶液的熒光強度。

1.2.7 方法檢出限的測定與計算 在狹縫寬度為5 nm、激發波長為370 nm條件下,分別測定10份濃度為0.10 μg/mL的直鏈淀粉標準品溶液的熒光強度,參考文獻[12]方法,按如下公式計算方法檢出限:

式中:CL-方法檢出限(μg/mL);s-標準偏差;k-標準曲線斜率。

1.2.8 加標回收率試驗 采用文獻[13]方法測定平均回收率和相對標準偏差。

1.2.9 熒光光譜法與國標法的比較 于4支25 mL比色管中分別加入0.60 μg/mL玉米淀粉、土豆淀粉溶液,在狹縫5 nm條件下,分別測定2支玉米淀粉、土豆淀粉溶液的熒光強度,平行測定6次;另參照國標GB 7648-1987分析方法[15],分別測定另2支玉米淀粉與土豆淀粉中直鏈淀粉的含量,平行測定6次。

1.3 數據處理

所有數據和圖表均采用Excel(2010版)和Orgin 8.5軟件處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

由實驗得出直鏈淀粉標準品溶液的標準曲線如圖1所示。

圖1 直鏈淀粉標準曲線Fig.1 Standard curve of amylose

由圖1可知,直鏈淀粉在0.10～0.70 μg/mL范圍內與熒光強度呈良好線性關系,其線性回歸方程為:y=26.768x+49.974,r=0.9996。

2.2 激發與發射光譜

按照1.2.3測定方法,測定直鏈淀粉的熒光光譜,結果如圖2、圖3所示。由圖2～圖3可知,直鏈淀粉激發波長和發射波長分別為370和422 nm。這與文獻[14]報道的淀粉-水懸浮液的熒光位于300～450 nm相吻合。直鏈淀粉是由α-D-葡萄糖通過α-D-1,4糖苷鍵連接而成的鏈狀分子,其分子結構中含有C-O-C的環醚鍵,吸光后環醚鍵C-O-C中的氧未共享電子發生n→π*躍遷,從而產生了熒光[14]。

圖2 直鏈淀粉激發光譜Fig.2 Excitation spectrum of amylose

圖3 直鏈淀粉發射光譜Fig.3 Emission spectrum of amylose

2.3 溶液放置時間的確定

按照1.2.4測定方法,測定放置時間對溶液熒光強度的影響,結果見圖4。由圖4可知,隨著放置時間的延長,溶液的熒光強度無明顯變化,因此,本試驗采用即測即配溶液的方法。

圖4 放置時間對熒光強度的影響Fig.4 Effect of placement time on luorescence intensity

2.4 測定溫度的確定

按照1.2.5測定方法,測定溫度對熒光強度的影響,結果如圖5所示。由圖5可知,隨著溫度的增大,在32 ℃之前淀粉的熒光強度呈上升趨勢,32 ℃到44 ℃呈下降趨勢,從48 ℃到56 ℃又在緩慢增加,但仍然小于32 ℃時的熒光,即32 ℃溫度時熒光最大。因此,實驗測定溫度為32 ℃。其原因可能是32 ℃之前,隨著溫度的增加,直鏈淀粉中的C-O-C環醚鍵中的氧未共享電子更易發生n→π*躍遷,使熒光強度最大,隨著溫度繼續升高,光化分解的發生熒光量子產率減小,熒光淬滅。熒光強度減小。

圖5 溫度對熒光強度的影響Fig.5 Effect of temperature on florescence intensity

2.5 干擾試驗

因為淀粉脫脂后的主要成分是直鏈淀粉和支鏈淀粉,因此,本試驗分別測定了支鏈淀粉對直鏈淀粉含量測定的干擾情況。

直鏈淀粉與支鏈淀粉不同的濃度比對熒光強度的影響如圖6所示。由圖6可知,在固定濃度的直鏈淀粉混合溶液中,隨著支鏈淀粉濃度比例的增大,熒光強度數值基本不變,說明支鏈淀粉的存在基本不影響直鏈淀粉含量的測定,這與文獻[14]的結果也是吻合的。

圖6 支鏈淀粉和直鏈淀粉的濃度比對熒光強度的影響Fig.6 Effect of concentration ratio of amylopectin and amylose on fluorescence intensity

2.6 方法檢出限的計算

按照1.2.7測定方法,測定10份濃度為0.10 μg/mL的直鏈淀粉溶液的熒光強度,計算得標準偏差為s=0.233,按照1.2.7檢出限計算公式計算得方法檢出限CL為0.026 μg/mL。

2.7 加標回收率和相對標準偏差的測定

按照1.2.8試驗方法,分別對0.20,0.40,0.60 μg/mL 3個水平做回收率試驗。平行測定6次。并根據2.1線性回歸方程計算直鏈淀粉含量和加標回收率。結果見表1。

表1 加標回收試驗結果Table 1 Results of recovery experiment

由表1可知,樣品的回收率分別為94.5%～121.7%,相對標準偏差為2.42%～3.24%,說明該方法準確度和精密度均好。

2.8 熒光光譜法與國標法的比較分析

根據2.1線性回歸方程計算直鏈淀粉在原淀粉中所占的百分含量和相對標準偏差;參照國標GB 7648-1987分析方法[15]測定的結果見表2。

表2 樣品中直鏈淀粉含量測定結果(n=6,%)Table 2 Determination results of amylose content in the sample(n=6,%)

由表1數據得出玉米淀粉與土豆淀粉的平均回收率均優于國標分析法,說明對于玉米淀粉與土豆淀粉,熒光光譜法的精密度比單波長分光光度法的精密度高。不管是玉米淀粉還是土豆淀粉,熒光光譜法的相對標準偏差均比國標GB 7648-1987分析方法的相對標準偏差小,說明熒光光譜法的準確度比國標GB 7648-1987分析方法準確度高,其原因可能與國標GB 7648-1987分析方法的原理有關,國標法的原理是淀粉與碘形成碘-淀粉復合物的過程有特殊的顏色反應,支鏈淀粉與碘生成棕紅色復合物,直鏈淀粉與碘生成深藍色復合物,在淀粉總量不變的條件下,將這兩種淀粉分散液按不同比例混合,在一定的波長和酸度條件下與碘作用,生成由紫紅到深藍的一系列顏色,根據吸光度與直鏈淀粉濃度呈線性關系,可用分光光度計進行測定。在這個過程中,兩種顏色的相互影響,可能會造成其中每種顏色吸光度測定的不準確,從而導致測算的精密度和準確度較差。

3 結論

本試驗以超市購買的玉米淀粉、土豆淀粉為樣品,應用熒光光譜分析技術建立了熒光光譜法測定淀粉中直鏈淀粉的方法。用該方法測定淀粉中的直鏈淀粉,不需要任何化學試劑,直接測定淀粉溶液的熒光強度即可,方法簡單、快速,為淀粉及淀粉食品或淀粉材料中直鏈淀粉的測定提供了一種準確、靈敏的方法。