刺參粗多糖對糖酵解與有氧氧化過程關鍵酶活性的影響

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(大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

能量代謝是有機體在物質代謝中能量的產生、釋放、轉換及利用的過程。細胞的主要能量來源為糖代謝,葡萄糖在體內主要以糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation,OXPHOS)兩種途徑進行氧化分解,其中OXPHOS是糖代謝的主要方式[1]。腫瘤細胞具有多種典型的特征,代謝異常是腫瘤細胞十大顯著特點之一[2]。腫瘤糖代謝異常十分關鍵,德國生理學家Warburg提出了著名的“Warburg效應”[3],即在供氧充足時,腫瘤細胞大多通過糖酵解途徑產能,并產生大量的乳酸,卻很少利用產能更高的OXPHOS。癌細胞與正常細胞的能量代謝方式不同,正常細胞有氧條件下以有氧氧化為主,只有供氧不足時才會以糖酵解途徑供能,而癌細胞無論是有氧還是缺氧條件下均優先以糖解途徑供能,這種能量代謝方式使其在缺氧條件下具有更強的耐受能力[4],同時推測線粒體代謝異常是腫瘤發生的基礎[5]。腫瘤以細胞能量代謝途徑轉換為特點,從正常細胞依賴的OXPHOS產能向糖酵解產能的轉換[6]。在糖酵解過程中有多種關鍵酶,如己糖激酶(Hexokinase,HK)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(3-glyceraldehyde phosphate delydrogenase,GAPDH)、乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)等,這些酶的活性高低直接影響糖酵解途徑[7],這些糖酵解關鍵酶也在惡性腫瘤細胞中高度表達,若抑制糖酵解關鍵酶,阻斷糖酵解途徑,從而切斷腫瘤的能量供應,則可抑制大多數腫瘤細胞中能量的合成,從而減緩腫瘤細胞的增殖與發展[8]。近年來,線粒體在腫瘤發生、發展中的作用及在癌癥診斷治療中的意義日益受到關注。對于OXPHOS的關鍵酶,如丙酮酸脫氫酶(Pyruvate Dehydogenase,PDH)、線粒體復合體Ⅰ、線粒體復合體Ⅴ(ATP合酶)等,通過提高其活性來促進OXPHOS產能,進而有可能抑制癌細胞的增殖。

海參自古以來就被奉為營養佳品,營養價值主要源于由氨基半乳糖、己糖醛酸、巖藻糖、硫酸基組成的多糖[9],其糖鏈的部分羥基可發生硫酸酯化,且硫酸化程度與其抗腫瘤作用相關[10]。研究發現海參多糖具有明顯的抗腫瘤活性,其抑瘤率為73.56%[11],海參多糖在體外呈濃度依賴性促進人腎癌細胞786-0凋亡[12],北極海參多糖具有較強的體外抗腫瘤作用[13]。目前海參多糖的抗腫瘤作用研究較多,但是對其與糖酵解與有氧氧化的聯系方面報道較少。

刺參具有“海參之冠”之稱,本文選用刺參粗多糖(Stichopusjaponicuscrude polysaccharides,SJP)為研究對象,從改善線粒體生物能學即激活氧化磷酸化產能,抑制糖酵解產能的角度探索其防癌機制,為癌癥研究提供新的視角、新的思路和新的希望。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠 雄性,重量(22.13±0.95) g,24只,大連醫科大學動物實驗中心(合格證號:SCXK 2014-0002);干刺參 大連曉芹食品有限公司;木瓜蛋白酶(酶活80萬U/g)、胃蛋白酶(酶活3000～3500 NFU/g)、胰蛋白酶(酶活>250NFU/mg) 北京索萊寶科技有限公司;LDH試劑盒(生產批號:20171028)、GAPDH檢測試劑盒(生產批號:20171108)、HK測試盒(生產批號:20171102)、PDH試劑盒(生產批號:20171102)、線粒體復合體Ⅰ活性試劑盒(生產批號:20171102)、線粒體復合體Ⅴ活性測試盒(生產批號:20171102) 北京索萊寶科技有限公司;牛血清白蛋白 荷蘭Boehringer Mannheim公司;考馬斯亮藍G-250染色液 美國Fluka公司;其他試劑 均為國產或進口分析純。

中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;TGL-18M臺式高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;92-IIN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;Polystat 34恒溫水浴鍋 美國Techne公司;UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SJP的提取

1.2.1.1 木瓜蛋白酶水解法提取SJP 用中草藥粉碎機將干刺參粉碎,過60目篩,所得為刺參干粉,稱取刺參干粉10 g,加入丙酮溶液60 mL于4 ℃浸泡24 h,倒出丙酮溶液,刺參粉室溫(20 ℃)下揮發完全,然后放置24 h(20 ℃),向揮出丙酮的刺參干粉中加入木瓜蛋白酶1 g與0.1 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH為6.0,含半胱氨酸鹽酸鹽和乙二胺四乙酸二鈉的濃度為5 mmol/L)300 mL,60 ℃水浴24 h。取出冷卻,10000 r/min 20 ℃離心5 min,收集上清液。向上清液中加入10%的氯化十六烷基吡啶溶液(w/v)16 mL,靜置24 h,分層后6000 r/min 20 ℃離心20 min,收集沉淀。用20 mL NaCl乙醇溶液(3 moL/L NaCl溶液:乙醇=100/15 v/v),將沉淀完全溶解。向溶解液中加入95%乙醇溶液40 mL,充分攪拌后4 ℃靜置12 h過夜。溶液分層后6000 r/min 4 ℃離心20 min,用10 mL 80%和95%乙醇溶液洗沉淀2～3次后,60 ℃烘干2 h,即得SJP,采用硫酸苯酚法[14]測定糖含量,計算SJP糖部分含量為30%,考慮到糖鏈上有部分羥基發生硫酸酯化的影響,且硫酸基含量占多糖的30%左右[15],故實際SJP多糖含量約為60%。

1.2.1.2 胃蛋白酶與胰蛋白酶水解法提取SJP 具體操作方法參照文獻[16],所得SJP以硫酸苯酚法測定糖含量,經計算為33%,考慮到硫酸基的影響,故實際SJP多糖含量約為63%。

1.2.2 動物分組與處理 實驗用清潔級小鼠,適應性飼養1周后隨機分成正常對照組、SJP 1組(木瓜蛋白酶水解法制備的刺參多糖)、SJP 2組(胃蛋白酶與胰蛋白酶水解法制備的刺參多糖),每組8只小鼠,稱重(g),給藥10 d,觀察小鼠狀態。SJP組灌胃劑量為200 mg/kg/d,每日1次,正常對照組小鼠每天灌胃等體積生理鹽水。結束后記錄灌藥后鼠重(g),處死小鼠,迅速取出肝臟、骨骼肌等組織,進行相應處理并檢測HK、GAPDH、LDH、PDH、線粒體復合體Ⅰ與復合體Ⅴ活性等各項指標。

1.2.3 糖酵解關鍵酶活性測定 檢測糖酵解過程中關鍵酶HK、GAPDH、LDH活性。

HK活性測定用小鼠肝組織,GAPDH與LDH活性測定用小鼠股四頭肌。按照相應的試劑盒說明書進行實驗操作并計算結果。

1.2.4 有氧氧化關鍵酶活性測定 檢測糖有氧氧化過程中關鍵酶PDH、線粒體復合體Ⅰ與復合體Ⅴ活性。PDH、線粒體復合體Ⅰ與復合體Ⅴ活性用小鼠肝組織進行測定。按照相應的試劑盒說明書進行操作并計算結果。

1.2.5 生物能指數測定 生物能指數是指線粒體的ATP合酶(復合體Ⅴ)與糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(3-GAPDH)的活性比。復合體Ⅴ與3-GAPDH的活性已分別在1.2.3與1.2.4中進行測定。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 糖酵解關鍵酶活性分析

糖酵解是腫瘤細胞能量供應的重要手段,腫瘤糖酵解活性的升高在細胞水平表現為乳酸生成與葡萄糖消耗比的增加[17],糖酵解過程產生的中間代謝產物又可被腫瘤細胞利用,用于合成細胞增殖所需的原料,從而促進腫瘤的增殖、遷移等。研究發現,小鼠乳腺癌細胞的糖酵解活性約是正常細胞的2～17倍[18]。

糖酵解過程有賴于關鍵性酶的催化。HK催化糖酵解的啟動步驟,使葡萄糖磷酸化形成葡萄糖-6-磷酸,HK 4種亞型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)在正常細胞中通常低表達,而在多種腫瘤細胞中呈現高表達[19],王秀等[20]研究表明,可通過降低卵巢癌細胞中的HK活性,抑制卵巢癌細胞增殖。由表1可知,灌藥組小鼠HK活性與對照組相比均下降,且呈現顯著性(p<0.05)差異,SJP 1組HK活性高于SJP 2組,但兩組間無顯著性差異(p>0.05),說明SJP能抑制HK活性,從而抑制糖酵解過程的第一步,使產能向OXPHOS方向進行。

表1 SJP對糖酵解酶活性的影響Table 1 Effects of SJP on glycolytic enzyme activity

GAPDH催化甘油醛-3-磷酸形成1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH在多種癌癥中上調,如肝癌、肺癌,但其具體作用及機制尚不明確。研究表明GAPDH能夠激活細胞增殖,加劇肝癌的發生發展。因此得出GAPDH可以促進癌癥的發生[21]。而實驗結果表明與對照組相比,灌藥組小鼠GAPDH活性均降低,且呈現顯著性差異(p<0.05),SJP 1組GAPDH活性高于SJP 2組,說明SJP可抑制GAPDH活性,進而可能阻止癌癥的發生。

LDH催化丙酮酸生成乳酸,是糖酵解過程最后一步反應的催化酶,推動著糖酵解循環的進行。LDH有5種同工酶,其中乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)與腫瘤的發生最為密切。c-Myc上調LDHA基因的表達,使得腫瘤細胞進行高效有氧糖酵解,并可促進腫瘤的生長[22]。已有研究報道,LDHA在神經膠質瘤中有較高表達,而在正常的神經組織和細胞中的表達較低[23]。灌藥組小鼠的LDH與對照組比較均下降,且呈現顯著性差異(p<0.05),SJP 1組LDH活性高于SJP 2組,說明SJP可抑制LDH活性,進而抑制糖酵解過程。總之,SJP能抑制HK、LDH和GAPDH的活性,進而抑制糖酵解的進行,影響其產能,推測SJP可能具有抑制腫瘤增長與擴散作用。

2.2 有氧氧化關鍵酶活性分析

線粒體OXPHOS是機體的重要能量來源,由線粒體內膜呼吸鏈完成,呼吸鏈復合體是主要參與者。正常生理狀態下,人體80%以上的能量來源于線粒體OXPHOS[24]。PDH是丙酮酸的關鍵調節劑,在線粒體中將丙酮酸轉變為乙酰輔酶A,進入三羧酸循環進而通過OXPHOS產能。PDH活性的重要調節劑是PDH激酶(pyruvate dehydrogenase kinase,PDK),通過促使PDH特定絲氨酸位點的磷酸化使PDH失活[25],導致丙酮酸進入線粒體的量減少,生成大量的乳酸。一些PDK的亞型在各種腫瘤細胞中過度表達[26],且對維持腫瘤有氧糖酵解起到重要作用。若提高PDH活性則可促進丙酮酸進入三羧酸循環,使產能向OXPHOS方向進行。

線粒體呼吸鏈復合體I是呼吸鏈電子傳遞的起始復合體,位于線粒體內膜上,將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所帶電子通過FMN和Fe-S簇中的Fe原子傳給泛醌,將質子從基質中轉移到線粒體膜間腔,形成跨內膜的質子電化學梯度,驅動復合體Ⅴ合成ATP[27-28]。

復合體V是線粒體呼吸鏈的最后一個復合物,在線粒體中通過電化學梯度傳遞質子,以ADP、Pi及Mg2+為原料合成ATP,為細胞供能[29]。線粒體呼吸受損引起的NADH升高可導致Akt通路的激活,Akt通路的激活可促進腫瘤細胞的糖酵解[30]。

由表2可知,灌藥組小鼠的PDH、線粒體復合體I、復合體V的活性與對照組相比均有所升高,且呈現顯著性差異(p<0.05),SJP 1組PDH、線粒體復合體I、復合體V的活性均低于SJP 2組,且兩組間均無顯著性差異(p>0.05),說明SJP可促進上述酶的活性,進而促進OXPHOS進行,如果可以調節腫瘤代謝途徑,控制腫瘤的能量代謝方式,使其向OXPHOS產能方向進行,進而抑制腫瘤細胞增殖,則可以有針對性的治療惡性腫瘤。

表2 SJP對有氧氧化酶活性的影響Table 2 Effects of SJP on aerobic oxidase activity

2.3 鼠重與生物能指數分析

多種腫瘤細胞中都存在線粒體功能紊亂,線粒體功能異常在腫瘤發生發展的各個階段也扮演重要的角色。

由表3可知，灌藥前SJP組鼠重與對照組比較均無顯著性差異(p>0.05),灌藥后SJP組與對照組比較均有所增加,且SJP 2組存在顯著性差異(p<0.05),SJP組灌藥前與灌藥后鼠重均增加且存在顯著性差異(p<0.05),說明SJP對小鼠的生長有促進作用。灌藥后小鼠好動,毛色光鮮順滑。

表3 SJP對鼠重與生物能指數的影響Table 3 Effects of SJP on the weight of mice and bioenergetic index

生物能指數是指線粒體的ATP合酶與糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶的活性比,其決定腫瘤的侵襲性,生物能指數也從側面說明了線粒體的活性高低。SJP組的生物能指數與對照組相比均有所升高,且有顯著性差異(p<0.05),SJP 2組有較顯著差異(p<0.01)。SJP使生物能指數升高,說明其使小鼠更傾向于OXPHOS產能,從而可能利于抑制腫瘤的侵襲。

3 討論與結論

Warburg效應在各種惡性腫瘤細胞及腫瘤組織中普遍存在,例如乳腺癌、肝癌、胃癌及腦組織惡性腫瘤等[31-32],大部分惡性腫瘤已經顯示糖酵解效率和乳酸產量均上調[33]。Warburg效應不僅增強了糖酵解作用,同時也通過將丙酮酸轉化為乳酸而抑制了線粒體OXPHOS的作用。糖酵解為腫瘤細胞的生存和侵襲提供了優勢條件,有益于腫瘤細胞的侵襲和轉移[34]。研究表明,為了適應周圍微環境,腫瘤細胞可能通過異常信號通路重排代謝方式,重排的代謝方式有利于維持腫瘤的生長增殖等[35]。另一方面,為了對自身起到有效的適應性保護,腫瘤細胞需要大量能源來維持高耗能的耐藥通路,對糖酵解的依賴進一步增加[36]。因此,如果能夠對腫瘤細胞的代謝方式進行有效轉變,就有可能遏制腫瘤細胞惡性增殖,并改善腫瘤細胞對治療藥物的敏感性。本文實驗結果表明兩種方法提取的SJP均能抑制糖酵解關鍵酶活性,促進OXPHOS過程關鍵酶活性,說明SJP有可能通過改變代謝方式來抑制癌癥的發生,但其具體的作用機制還需更進一步探索。