靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠免疫功能的影響

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(中山大學生命科學學院,廣東廣州 510275)

靈芝屬于擔子菌綱多孔菌科(Polyproraceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌,是赤芝(G.lucidumKarst)和紫芝(G.JaponicumLloyd)的總稱[1],是一種重要的藥食用真菌,素有“仙草”和“瑞草”的美稱。靈芝孢子是子實體成熟后從菌蓋子實層內噴射出來的粉末狀的生殖細胞,其所含的營養物質是靈芝子實體的數十倍[2],主要活性成分有糖肽類、氨基酸類、三萜類、核苷類、脂肪酸類、呋喃類衍生物、甾醇類、生物堿類和微量元素等[3-4],具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗衰老、調節免疫、保肝護肝、降血糖血脂等多種生理活性[5-8]。

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物芽孢或樹干破皮傷口處采集來的樹脂(樹膠),并混入蜜蜂上顎腺的分泌物,與少量花粉、蜂蠟等加工而成的一種具有芳香氣味的固體膠狀粘性物質[9],有“紫色黃金”之稱。目前已從蜂膠中分離出300多種化學成分,主要有效成分包括黃酮類、酚酸類、酯類、多糖、氨基酸、揮發性物質、萜類等[10-12],具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤、增強免疫、抗氧化、肝保護、調節血糖血脂等多種生理活性[13-16]。

現今市場上出現了許多靈芝孢子和蜂膠的復合產品,但關于此復方生理作用的研究多為降脂[17]、抑制胃潰瘍[18]等方面,而在免疫調節方面的研究極少。王麗妮[19]證明由靈芝、蜂膠、精氨酸、蛋氨酸、β-胡蘿卜素、富硒酵母組成的“壽百星”膠囊具有增強非特異性免疫和特異性細胞免疫的作用,但是關于靈芝孢子和蜂膠組成的復方對非特異性免疫、細胞免疫以及體液免疫的研究尚未見文獻報道。本實驗以靈芝孢子粉和蜂膠組成的復合物為原料,研究其對小鼠非特異性免疫、細胞免疫以及體液免疫的作用,期待為此類復合功能產品的開發應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝孢子粉蜂膠復合物 由廣州市眾享生物科技有限公司提供,復合物由靈芝孢子粉和蜂膠按質量1∶1組成,其中靈芝孢子粉來源于廣西百色地區,蜂膠來源于大別山,靈芝孢子粉采用低溫破壁,天然蜂膠凍干后研磨成細粉,將兩者混合攪拌均勻,所得復合物為棕褐色粉末,在蒸餾水中呈深棕色混懸液,實驗時用蒸餾水配成所需濃度;SPF級昆明種雌性小鼠 共160只,4～5周齡,體重為18～22 g,由中山大學實驗動物中心提供,實驗動物生產許可證號為SCXK(粵)2016-0029,飼養于中山大學(生命科學大學院中藥與海洋藥物研究所),試驗單位使用許可證編號為SYXK(粵)2014-0020;無菌脫纖維雞血、無菌脫纖維羊血、補體、小牛血清 廣州鴻泉生物科技有限公司;Drabkin’s Reagent(都氏試劑)、L-谷氨酰胺 美國sigma公司;印度墨水、SA緩沖液、四甲基偶氮唑藍(MTT)、刀豆蛋白(ConA) 上海源葉生物科技有限公司;RPMI-1640細胞培養液 蘇州賽默飛世爾儀器有限公司;hanks緩沖液、青霉素鈉、硫酸鏈霉素、β-巰基乙醇 北京索萊寶生物科技有限公司;Gimsa染液 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS) 北京藍景科信技術有限公司;24孔培養板、96孔培養板 美國康寧;實驗過程中所用的化學試劑 均為國產分析純。

754紫外可見分光光度計 上海公譜儀器有限公司;HERAcell 150i二氧化碳培養箱和Multiskan FC酶標儀 上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;BA210型LED Digital Motic顯微鏡 麥克迪奧實業集團有限公司;LXJ-II C低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠;MIKRO 120小型臺式高速離心機 德國Hettich。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及灌胃 分組:將整個實驗分成四個免疫組,每組小鼠40只,再將40只小鼠隨機分成4組,即對照組、靈芝孢子粉蜂膠低、中、高劑量組。其中免疫一組進行免疫臟器質量測定和小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗;免疫二組進行遲發型變態反應(DTH)和血清溶血素的測定;免疫三組進行小鼠單核-巨噬細胞碳粒廓清實驗;免疫四組進行刀豆蛋白(Con A)誘導的脾淋巴細胞轉化實驗。實驗方法參照國家衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)[20]中增強免疫力功能檢測方法進行。

灌胃:參考張艷[21]實驗方法中關于劑量的選取,實驗設計了低、中、高劑量組,即75、150、450 mg/kg bw,分別相當于人體推薦劑量的5、10、30倍。將靈芝孢子粉蜂膠復合物粉末用蒸餾水配成所需濃度,以灌胃的方式對小鼠進行給藥,灌胃劑量為0.1 mL/10 g bw,每天一次,連續30 d,對照組給予等體積的蒸餾水。

1.2.2 小鼠體重變化的測定 實驗開始前稱重并記錄每只小鼠的重量,最后一次給藥24 h后稱重并記錄其體重。

1.2.3 免疫臟器指數測定 小鼠最后一次給藥24 h后,稱重,頸椎脫臼法處死小鼠,解剖取胸腺和脾臟,用濾紙吸干表面血污后用電子天平分別稱重,計算胸腺指數和脾臟指數。

1.2.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法) 最后一次給藥24 h后,腹腔注射1 mL 20%的雞紅細胞懸液,30 min后頸椎脫臼處死小鼠,將其腹部朝上固定在鼠板上,正中剪開腹壁皮膚,經腹腔注射2 mL生理鹽水,用手輕輕按揉腹部30次。用吸管吸出腹腔洗液,平均分滴于兩片載玻片上,放入墊有濕紗布的搪瓷盒中,放置在37 ℃孵箱中溫育30 min。溫育結束后在生理鹽水中漂洗,除去未貼片細胞。取出晾干,以1∶1丙酮甲醇溶液固定5 min,然后以4%(體積分數)Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min,用蒸餾水漂洗后取出晾干,在40倍顯微鏡下觀察計數,按下式計算吞噬率和吞噬指數。

1.2.5 綿羊紅細胞(SRBC)誘導小鼠遲發型變態反應(足趾增厚法) 實驗結束前5 d,通過腹腔注射0.2 mL(約1×106個SRBC)2%(體積分數)的SRBC進行免疫。4 d后,測量左后足趾部厚度,然后在測量部位皮下注射20% SRBC,每只小鼠的注射劑量為20 μL(約1×102個SRBC),24 h后測量左后足趾部厚度。同一部位測量三次,兩次測量厚度的平均值之差即可反映小鼠遲發型變態反應(DTH)的程度。

1.2.6 半數溶血值(HC50)的測定 實驗結束前5 d,通過腹腔注射0.2 mL(約1×106個SRBC)2%的SRBC進行免疫。5 d后,摘除眼球取血置于離心管內,室溫放置約1 h,用注射器針頭將凝固血與管壁剝離,使血清充分析出,室溫下2000 r/min離心10 min,收集血清。用SA緩沖液將血清稀釋200倍,取稀釋后的血清1 mL置試管內,依次加入10% SRBC 0.5 mL、補體1 mL(用SA緩沖液按1∶10稀釋),另設不加血清的(以SA緩沖液代替)對照管。37 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min后在冰浴上終止反應,2000 r/min離心10 min,取上清液1 mL于新試管中,加入3 mL都氏試劑;同時取0.25 mL 10% SRBC于另一只試管內,加入3.75 mL都氏試劑,充分搖勻,放置10 min后,以對照管作空白,540 nm處分別測定各管的光密度值,按下式計算半數溶血值。

1.2.7 小鼠單核-巨噬細胞碳粒廓清實驗 最后一次給藥24 h后,通過尾靜脈注射用生理鹽水稀釋了4倍的印度墨汁,注射劑量為0.1 mL/10 g bw。注入墨汁后立即開始計時,于2 min(t1)、17 min(t2)時分別通過眼球內眥靜脈叢取血20 μL,立即加入到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液作空白對照,用分光光度計測量600 nm處的光密度值(OD)。取血完后將小鼠脫頸椎處死,解剖取其脾臟和肝臟,用濾紙吸干表面的血污后稱重。按下式計算吞噬指數a。

式中:k表示未校正的吞噬指數;a表示經校正的吞噬指數;OD1和OD2分別為2、17 min時的光密度值。

1.2.8 刀豆蛋白(Con A)誘導的脾淋巴細胞轉化實驗(MTT法) 最后一次給藥24 h后,采用頸椎脫臼法處死小鼠,無菌取脾,置于盛有Hank’s液平皿中的200目無菌不銹鋼網上,用注射器針芯輕輕研磨脾臟,制成單細胞懸液。用Hank’s液洗滌3次,每次1000 r/min離心10 min。然后將細胞懸浮于1 mL RPMI-1640完全培養液中,顯微鏡下進行細胞計數,并調整細胞濃度為2×106個/mL。將細胞懸液分兩孔加入到24孔培養板中,每孔1 mL,其中一孔加入75 μL Con A液(終濃度為7.5 μg/mL),另一孔不加Con A液作為對照,置于二氧化碳培養箱中以5% CO237 ℃條件培養72 h。培養結束前4 h,每孔輕輕吸去上清液0.7 mL,加入不含小牛血清的RPMI-1640培養液0.7 mL,同時加入50 μL MTT(5 mg/mL),繼續培養4 h。培養結束后,每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打混勻,使紫色結晶完全溶解,然后分裝到96孔培養板中,每孔作3個平行,用酶標儀測量570 nm波長下的光密度值。脾淋巴細胞的增殖能力可表示為加Con A液孔的光密度值減去不加Con A液孔的光密度值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠體重變化的影響

從表1可以看出,四個免疫組低、中、高劑量的靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠體重的變化與對照組相比無顯著統計學差異(p>0.05),說明該復合物對小鼠體重的變化無明顯影響。但是同一劑量不同免疫組之間的體重變化存在一定差異,對照組小鼠中免疫一組的體重變化與其它三個免疫組相比具有顯著統計學差異(p<0.05);給予低劑量受試物中免疫一組小鼠體重變化與其它三個免疫組相比有顯著差異(p<0.05);給予中劑量受試物中免疫一組小鼠體重變化與免疫二組之間差異顯著(p<0.05);給予高劑量受試物中免疫一組體重變化與免疫四組之間差異顯著(p<0.05),說明小鼠的體重變化可能受外界條件及遺傳特性等因素的影響。

表1 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠體重的影響Table 1 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on body weight of mice

2.2 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠免疫臟器指數的影響

脾臟和胸腺是免疫系統中重要的免疫器官,其質量在一定程度上可反映免疫功能的大小,從表2可知,低、中、高劑量靈芝孢子粉蜂膠處理組的小鼠脾臟指數和胸腺指數與對照組相比雖然都有所提高,但均無顯著統計學差異(p>0.05),表明靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠脾臟和胸腺的質量無明顯影響,對免疫器官無刺激作用。

表2 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠免疫臟器指數的影響Table 2 Effect of Ganoderma lucidum spores propolis complex on immune organ index of mice

2.3 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

從表3中可以看出,中、高劑量靈芝孢子粉蜂膠復合物處理組的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數顯著(p<0.05)高于對照組,而低劑量組小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數與對照組相比無顯著(p>0.05)差異。以上結果表明靈芝孢子粉蜂膠復合物能夠顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力。

表3 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 3 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on peritoneal macrophage phagocytosis ability to chicken-red-blood cells of mice

2.4 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠遲發型變態反應(DTH)的影響

從表4可以看出,與對照組相比,中、高劑量處理組小鼠的足趾腫脹度極顯著升高(p<0.01),而低劑量處理組小鼠的足趾腫脹度與對照組相比無顯著差異(p>0.05),結果說明靈芝孢子粉蜂膠復合物具有促進小鼠遲發型變態反應的作用。

表4 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠遲發型變態反應的影響Table 4 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on delayed-type hypersensitivity of mice

2.5 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠血清溶血素水平的影響

由表5可知,三個劑量組小鼠血清半數溶血值隨靈芝孢子粉蜂膠復合物灌胃劑量的增加而升高,低劑量組與對照組相比具有顯著統計學差異(p<0.05),中、高劑量組與對照組相比其統計學差異極顯著(p<0.01)。以上結果表明,靈芝孢子粉蜂膠復合物能顯著提高小鼠血清溶血素水平。

表5 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠血清溶血素水平的影響Table 5 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on serum hemolysin capacity of mice

2.6 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠單核—巨噬細胞碳粒廓清能力的影響

由表6可知,三個劑量靈芝孢子粉蜂膠復合物處理組小鼠單核—巨噬細胞的碳廓清吞噬指數與對照組相比均無顯著差異(p>0.05),說明該復合物對單核-巨噬細胞的碳粒廓清能力無明顯的增強作用。胡怡秀等[22]通過實驗證明1.101 g/kg bw的蜂膠能明顯增強小鼠的碳粒廓清能力(p<0.05),張榮標等[23]通過灌胃給予ICR清潔小鼠125、250、750 mg/kg bw的破壁靈芝孢子粉30 d后進行免疫指標檢測,結果顯示250 mg/kg bw的靈芝孢子粉能夠顯著增強小鼠的碳粒廓清能力(p<0.05)。兩位的研究結果與本實驗結果不同,可能由于劑量效應導致,高劑量復合物中靈芝孢子粉和蜂膠的劑量均為225 mg/kg bw,未達到胡怡秀以及張榮標實驗中引起碳廓清指數增強的劑量水平。

表6 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠碳粒廓清能力的影響Table 6 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on carbon clearance ability of mice

2.7 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

從表7可得知,三個劑量組的脾淋巴細胞增能力均高于對照組,且隨著劑量的加大其脾淋巴細胞的增殖能力也逐漸增加,但只有靈芝孢子粉蜂膠復合物中、高劑量處理組小鼠脾淋巴細胞增殖能力極顯著高于(p<0.01)對照組,而低劑量組小鼠脾淋巴細胞增殖能力與對照組相比無顯著差異(p>0.05)。結果說明靈芝孢子粉蜂膠復合物對脾淋巴細胞的增殖能力具有一定的促進作用。

表7 靈芝孢子粉蜂膠復合物對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響Table 7 Effect of Ganoderma lucidum spores and propolis complex on spleen lymphocyte proliferation ability of mice

3 討論與結論

本實驗結果顯示,與對照組相比,中、高劑量靈芝孢子粉復合物能夠提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力,說明該復合物對單核-巨噬細胞的功能具有促進作用;中、高劑量靈芝孢子粉復合物能顯著增強小鼠遲發型變態反應程度以及小鼠脾淋巴細胞增殖能力,說明該復合物對細胞免疫功能具有促進作用;低、中、高劑量靈芝孢子粉復合物能顯著提高血清溶血素水平,說明該復合物對體液免疫功能具有促進作用;根據國家衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003年版)中關于增強免疫力功能的結果判定標準,可認為靈芝孢子粉蜂膠復合物具有增強免疫力功能的作用。

本研究從非特異性免疫、體液免疫、細胞免疫三個方面證明了靈芝孢子粉蜂膠復合物能夠促進機體的免疫功能,為此類復合產品作為保健產品的推廣使用提供了可靠的理論支撐。但未深入探究靈芝孢子粉蜂膠復合物增強免疫功能的分子作用機制以及靈芝孢子粉和蜂膠間的作用效果是屬于協同還是拮抗,有必要在今后對其相互作用效果及作用機制作進一步探討,從而為此類復合物的應用研究提供更全面的參考信息。