金黃色葡萄球菌定性實驗的兩種方法比較

呂 輝，劉 霞，龔 維，劉 新，姚旭霞

(中國兵器工業(yè)集團第五三研究所，山東濟南 250031)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是葡萄球菌屬(Staphylococcus)的典型代表之一，菌體直徑約為0．8μm，小球形，常堆聚成葡萄串狀，革蘭氏陽性，無芽孢和莢膜［1］，別稱“嗜肉菌”，是人類的一種重要的病原菌［2］。它能夠產(chǎn)生腸毒素，導(dǎo)致腹瀉等腸道疾病，也可引起局部或者全身化膿感染［3］，嚴重可導(dǎo)致死亡。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界中，空氣、水、土壤、灰塵甚至是人的皮膚表面都可以找到。因此，在生物、醫(yī)藥和食品衛(wèi)生檢驗中，金黃色葡萄球菌的定性實驗都是重要的檢查項目。

在食品檢測中，對于金黃色葡萄球菌的定性實驗，通常采用GB 4789．10－2010《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中的第一法［4］(簡稱 標準方法)進行檢驗，主要是通過驗證金黃色葡萄球菌在不同平板上的菌落狀態(tài)和某些生理活動產(chǎn)生的生化反應(yīng)來判定是否有金黃色葡萄球菌的存在。隨著微生物檢驗技術(shù)的不斷發(fā)展，一些大型微生物自動鑒定儀能夠通過集成某些生化反應(yīng)，自動鑒定微生物的種類，使得微生物的鑒定更加高效便捷，在日常檢驗中的應(yīng)用逐步廣泛起來，因此也可以作為金黃色葡萄球菌定性檢測的重要方法。

1 實驗原理

1．1 標準方法

根據(jù)GB 4789．10－2010《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》中的第一法，采用觀察菌落在不同平板上的形態(tài)和血漿凝血酶實驗共同判定是否為金黃色葡萄球菌。

1．1．1 BP 平板

金黃色葡萄球菌在BP平板上，菌落為棕黑色或黑色，周圍會出現(xiàn)透明環(huán)。這是因為金黃色葡萄球菌可以還原亞碲酸鉀中的碲元素，此時顏色變?yōu)樽睾谏蚝谏Ｍ瑫r，金黃色葡萄球菌還可以產(chǎn)生卵磷脂酶，溶解培養(yǎng)基中的卵黃，從而形成透明環(huán)。

1．1．2 血瓊脂平板

金黃色葡萄球菌在血瓊脂平板上，菌落周圍會出現(xiàn)透明溶血環(huán)，是因為致病性的金黃色葡萄球菌能夠產(chǎn)生溶血毒素。

1．1．3 血漿凝固酶實驗

金黃色葡萄球菌能夠使新鮮的兔血漿凝固，因為金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝血漿酶，使血液凝固。

1．2 微生物自動鑒定儀法

梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)是一種高度集成化的儀器，需要與微生物鑒定卡共同使用，該卡片還有多個小格，添加了不同的化學(xué)試劑，菌液通過儀器被壓入卡片中，進入各個小格，與其中試劑發(fā)生生化反應(yīng)，在儀器的孵育箱中孵育一定時間，儀器每隔15 min自動掃描一次，將每個小格內(nèi)的顏色變化記錄下來，并綜合分析，鑒定出不同的菌種。

2 實驗儀器與試劑

2．1 標準方法

生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;百級超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;立式滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;血瓊脂平板，北京路橋技術(shù)股份有限公司;Baird－Parker瓊脂平板，北京路橋技術(shù)股份有限公司;兔血漿，北京路橋技術(shù)股份有限公司;革蘭氏染色液試劑盒，北京路橋技術(shù)股份有限公司。

2．2 微生物自動鑒定儀法

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)，梅里埃(上海)生物制品有限公司;4．5%生理鹽水，梅里埃(上海)生物制品有限公司;電子濁度儀，梅里埃(上海)生物制品有限公司;革蘭氏陽性菌鑒定卡，梅里埃(上海)生物制品有限公司。

3 實驗過程

3．1 標準方法

(1)預(yù)先配置225 mL17．5%氯化鈉肉湯溶液，加入到500 mL錐形瓶中，滅菌并涼至適宜溫度。量取樣品A 25 mL至錐形瓶中，于36℃ ±1℃搖床培養(yǎng)18～24 h后觀察。

(3)將上述培養(yǎng)物劃線接種到B－P平板上，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h或45～48 h后觀察菌落形態(tài);

將上述培養(yǎng)物劃線接種到血瓊脂平板上，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24h后觀察菌落形態(tài)。

(4)挑取B－P平板或血瓊脂平板上的可疑菌落1個或以上，采用革蘭氏染色法進行染色，制作玻片進行鏡檢，觀察細菌形態(tài)。

(5)挑取B－P平板或血瓊脂平板上的可疑菌落1個或以上，分別接種到5 mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h。

(6)取新鮮配置兔血漿0．5 mL，放入小試管，加入BHI培養(yǎng)物0．2～0．3 mL，震蕩搖勻，置36℃ ±1℃溫箱或水浴箱中，每半小時觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固(將試管傾斜或倒置時，呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。

3．2 微生物自動鑒定儀法［5］

(1)將樣品A接種到營養(yǎng)瓊脂平板上，36℃ ±1℃培養(yǎng)18～24 h，采用革蘭氏染色法進行染色，制作玻片進行鏡檢，觀察細菌形態(tài)，如有疑似的葡萄球菌，則進行下一步實驗。

(2)在小試管中加入3 mL滅菌的4．5%生理鹽水，挑取可疑菌落，加入試管中，用電子濁度儀測試濁度在0．5左右。

(3)將試管放入卡架左側(cè)，GP卡放入右側(cè)，試GP卡藍色管插入菌液中，放入儀器，進行操作。實驗完成后，在電腦中查看鑒定結(jié)果。

4 實驗結(jié)果

4．1 標準方法

4．1．1 營養(yǎng)瓊脂平板

如圖1a，菌落較小，圓形濕潤，具有金黃色光澤。

4．1．2 7．5%氯化鈉肉湯溶液

圖1d為未接種前7．5%氯化鈉肉湯溶液，圖1e為接種后培養(yǎng)24 h的7．5%氯化鈉肉湯溶液，可見明顯渾濁。

4．1．3 B －P 平板結(jié)果

如圖1b，菌落為棕黑色，周圍有透明環(huán)。

4．1．4 血瓊脂平板結(jié)果

如圖1c，菌落較大，有透明溶血環(huán)。

4．1．5 革蘭氏染色結(jié)果

如圖1f，革蘭氏染色陽性，藍紫色，球菌。

4．1．6 血漿凝固酶實驗結(jié)果

如圖1 g，兔血漿發(fā)生凝集反應(yīng)，證明有凝血漿酶產(chǎn)生。

圖1 實驗結(jié)果

4．2 微生物自動鑒定儀法

梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定結(jié)果見圖2。

圖2 梅里埃VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果:金黃色葡萄球菌，置信度:99%，耗時:4．25 h。

5 結(jié)論與展望

由各個實驗結(jié)果可以確定樣品A中確實存在金黃色葡萄球菌，且標準方法和微生物自動鑒定儀法均可以檢測出正確結(jié)果。通過標準方法檢測需要分別進行6項實驗，耗時4～5 d，而使用微生物自動鑒定儀VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)獲得實驗結(jié)果僅需4．25 h。由此可見，微生物自動鑒定儀比標準方法更加快速，且節(jié)省人工。并且VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定系統(tǒng)的最大載荷為30張卡，即一次最多可以檢測30個樣品，一次鑒定過程約6～8 h，效率更高。

在目前的食品安全國家標準中，對于金黃色葡萄球菌的定性試驗尚無微生物自動鑒定儀鑒定方法的介紹，隨著檢測科技的更新，微生物自動鑒定儀在生物、醫(yī)藥、食品衛(wèi)生檢驗等方向的應(yīng)用會更加廣范。