紅三葉新品系生理生化指標對低溫的響應機理

楊 丹， 田新會， 杜文華

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 中-美草地畜牧業可持續研究中心， 甘肅 蘭州， 730070)

植物的抗寒性是指對低溫做出應激反應的一種生理特性，受遺傳和環境的綜合影響。在低溫條件下，植物生理生化和組織刺激的反應機制包括對外界刺激的感受、信號的放大、傳輸及應答，從而引起相應的生理指標變化[1]。近年來，國內外學者在植物抗寒性生理特性方面研究較多，而且聚焦于培育和選擇抗寒性強的作物來提高農業經濟效益[2]。

隨著外界環境溫度的變化，植物體內的代謝和生理活動都會隨之發生改變，而這些生理代謝活動都是在水的參與下進行的。因此，植物在低溫條件下的水分變化情況，可作為檢驗植物抗寒性的重要內容之一[3]。葉綠素含量(Chlorophyll，CHL)在低溫脅迫下的變化情況，在一定程度上反映植物光合作用的變化規律，即植物對低溫脅迫的敏感性[4]。可溶性糖(Soluble Sugar，SS)是植物體內重要的滲透調節物質和代謝產物，在植物抗寒性研究中一直被廣泛關注，可溶性糖含量越高植物的抗寒性越強，反之則越弱。丙二醛(Malondialdehyde，MDA)作為細胞質膜過氧化的主要產物，在低溫條件下，抗寒性強的品種丙二醛含量低于抗寒性弱的品種[5]。葉片超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)被稱為植物體內消除氧自由基的保護酶系統，可作為抗寒性評價關鍵指標。這3者在機體抵御脅迫損傷時相輔相成，共同發揮著保護作用，使植株免受或少受活性氧傷害[6]。

紅三葉(Trifoliumpratense)又稱紅車軸草、紅荷蘭翹搖等，其營養豐富，蛋白質含量高，含有家畜所需的多種氨基酸及維生素，草質柔軟，適口性好，家畜喜食。紅三葉適宜在溫暖濕潤的環境下生長，超過最適氣溫(15～25℃)都會使其生長受到影響[7]，并直接影響其越冬性和翌年生物產量。崔英[8]和王曉軍[9]把幾項生理生化指標結合起來，對不同紅三葉品種的抗寒性進行了研究，鑒定了不同紅三葉品種抗寒性強弱。目前，國內對紅三葉耐低溫性方面的研究較少。孔令慧[7]以4℃低溫脅迫12 h為周期，對4個紅三葉材料的生理指標進行測定，結果表明，處理的時間越長，葉片含水量和葉綠素含量下降的程度也越大，但是相對膜透性、MDA含量及SOD，POD和CAT酶活性隨著低溫處理時間的延長而升高。本研究擬通過人工模擬4℃低溫環境，在孔令慧研究的基礎上，將低溫脅迫時間延長至21 d，以研究甘肅農業大學利用澳大利亞紅三葉品種Sensation和Renegade有性雜交培育紅三葉新品系的耐低溫性，旨在為紅三葉新品種培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為甘肅農業大學利用澳大利亞紅三葉品種Sensation和Renegade有性雜交，經無性繁殖得到的紅三葉新品系(R)，對照品種岷山紅三葉(CK1)和甘紅1號紅三葉(CK2)為國家審定登記的適宜于甘肅省種植的紅三葉品種。

1.2 試驗方法與設計

試驗于2017年4月7日在甘肅農業大學伏羲堂進行。取新鮮土壤與砂土按1:1比例進行均勻混合，裝入直徑22 cm，深15 cm的花盆中，分別選取籽粒飽滿的紅三葉新品系、甘紅紅三葉和岷山紅三葉種子各40粒種入花盆中，每個花盆種10粒，每個材料重復4次，放入光照培養箱(溫度20℃，光照20 h)，定期澆水，待紅三葉材料長出第5片葉片后，從每個花盆中隨機取5片新鮮葉片以備測定生理生化指標，作為第0 d數據。調節光照培養箱溫度為4℃，進行耐低溫性試驗[7]，分別于第7 d，14 d和21 d隨機選取3～5 g的新鮮葉片[10]，測定相應的生理生化指標。

1.3 測定指標與方法

葉片含水量采用烘干法測定，葉綠素含量采用丙酮反復提取法測定，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，葉片超氧化物歧化酶用氮藍四唑法測定，過氧化物酶采用愈創木酚法，過氧化氫酶采用紫外吸收法測定。以上各指標的測定參考植物生理學實驗指導[11]和植物生理學實驗分析測定技術[12]進行。

1.4 數據統計

采用EXCEL2010對參試紅三葉材料間，低溫脅迫天數間及紅三葉材料與低溫脅迫天數交互作用間的數據求平均值并進行數據整理和做圖，利用SPSS19.0進行方差分析，有顯著或極顯著差異時用DUNCAN法進行多重比較。

1.5 綜合評價

(1)用以下公式對各紅三葉材料各性狀的具體函數值進行計算：

(1)

(2)

上式中，Uij為i材料的j性狀的隸屬函數值，Xij為i材料的j性狀值，Xjmin為各紅三葉材料j性狀的最小值，Xjmax為各紅三葉材料j性狀的最大值。當j性狀與植物的耐低溫性成正相關時，用(1)式；當j性狀與植物耐低溫性成負相關時用(2)式。

(2)把每個紅三葉材料各個性狀的具體耐低溫隸屬值進行累加，并求出平均值:

(3)

上式中，Ui為i材料的耐低溫隸屬函數平均值，Ui越大，耐低溫性越強；反之越小[13]。

2 結果與分析

F測驗(表1)表明，供試紅三葉材料間，除LWC無顯著性差異外，MDA含量和CAT活性的差異顯著(P<0.05)，CHL、SS含量及POD和SOD活性的差異極顯著(P<0.01)；低溫脅迫天數間，除CHL含量和MDA含量的差異顯著外(P<0.05)，其他測定指標的差異極顯著(P<0.01)；紅三葉材料與低溫脅迫天數交互作用間，SS含量及CAT和POD活性的差異顯著(P<0.05)，LWC、CHL含量、MDA含量及SOD活性的差異極顯著(P<0.01)。需對上述存在顯著或極顯著的指標進行多重比較。

表1 紅三葉材料間、低溫脅迫天數間及紅三葉材料低溫脅迫天數交互作用間葉片含水量、葉綠素、 可溶性糖、MDA、POD、SOD、CAT的方差分析Table 1 Analysis of variance of content of leaf water,chlorophyll,soluble sugar,MDA,POD,SOD and CAT in red clover leaf

注：*表示差異達顯著水平(P<0.05)；**表示差異達極顯著水平(P<0.01)。下同

Note:*indicated significant difference at the 0.05 level;** indicated significant difference at the 0.01 level. The same as below

2.1 紅三葉材料間生理生化指標的差異

如表2所示，3份紅三葉材料中R的葉綠素含量最高，其次為CK1，CK2的葉綠素含量最低，且3者均存在顯著性差異(P<0.05)；可溶性糖含量顯著低于CK1和CK2；MDA含量最高，與2對照材料有顯著差異(P<0.05)，CK2的MDA含量最低，CK1居中；SOD活性顯著高于CK1和CK2(P<0.05)，CK1的SOD活性略低于CK2，但無顯著差異；POD活性最高，其次為CK1，CK2最低，3者間均存在顯著性差異(P<0.05)；CAT活性顯著高于CK1和CK2(P<0.05)，CK1的CAT活性略高于CK2，且2者間無顯著差異。

2.2 低溫脅迫天數間紅三葉材料生理生化指標的變化

由表2可知，供試紅三葉材料的葉片含水量和葉綠素含量，隨著脅迫天數的增加而逐漸降低，且脅迫處理后均顯著低于第0 d(P<0.05)，脅迫第21 d時達到最小值，與其他各處理天數間存在顯著性差異(P<0.05)；不同脅迫天數間，供試紅三葉材料的可溶性糖含量和MDA含量均存在顯著性差異(P<0.05)，且總體變化趨勢一致，即隨著脅迫天數的增加，2者均不斷上升，脅迫第21 d時達到最大值，且顯著高于其他處理(P<0.05)；葉片SOD，POD和CAT活性，隨著低溫脅迫天數的增加，呈先升高后下降的變化趨勢，且均在脅迫第14 d時達到最大值。

2.3 紅三葉材料×低溫脅迫天數交互作用間生理生化指標的差異

LWC：各處理間供試紅三葉材料的葉片含水量顯著性如圖1(a)所示。正常處理下R的葉片含水量最高，且與CK2存在顯著性差異(P<0.05)；隨著低溫脅迫時間的增加，3種紅三葉材料的葉片含水量變化程度均不相同，除第14 d紅三葉新品系R的葉片含水量顯著低于CK1和CK2外(P<0.05)，其他處理中，R與CK2間均無顯著差異，但顯著低于CK1(P<0.05)。

CHL含量：由圖1(b)可知，對照處理下，R的葉綠素含量顯著高于CK1和CK2(P<0.05)；隨著低溫脅迫時間的延長，紅三葉材料的葉綠素含量呈下降趨勢，第7 d和21 d時R的葉綠素含量顯著高于2對照，14 d時顯著低于CK1，但顯著高于CK2(P<0.05)

表2 紅三葉材料間、低溫脅迫天數間的生理生化指標的差異Table 2 The difference between the number of physiological and biochemical indexes of red clover materials, low temperature stress

注：同一指標同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note:Different letters within the same row for the sameparameter mean significant difference at the 0.05 level

圖1 紅三葉材料×低溫脅迫天數交互作用間葉片含水量和葉綠素含量的差異Fig.1 Differences of leaf water content and chlorophyll content in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days注：不同柱形圖間不同字母表示差異顯著。下同Note:Different letters among different bars mean significant difference at the 0.05 level. The same as below

SS含量：各處理間供試紅三葉材料的差異如圖2(c)所示。在正常條件下，R的可溶性糖含量顯著低于CK2(P<0.05)，但與CK1無顯著性差異；隨著低溫脅迫時間延長，7 d時R的可溶性糖含量顯著低于CK1和CK2(P<0.05)，14 d時其可溶性糖含量顯著高于CK1和CK2(P<0.05)；21 d時R的可溶性糖含量顯著低于CK1(P<0.05)，與CK2無顯著性差異。

MDA含量：由圖2(d)可知，在常溫(0 d)和低溫脅迫7 d時，R的MDA含量均顯著高于2對照材料；14 d時，R的MDA含量顯著低于CK1，但顯著高于CK2(P<0.05)；21 d時，R的MDA含量與CK1無顯著差異，但顯著高于CK2(P<0.05)。

SOD活性：對照處理下，R的SOD活性最低，但與2對照材料不存在顯著性差異；低溫脅迫7～21 d時，R的SOD活性均高于CK1和CK2；7 d時與CK2無顯著差異，但顯著高于CK1；14 d時與2對照均無顯著差異；21 d時顯著高于2對照(P<0.05)(圖3)

POD活性：無論是常溫還是低溫脅迫，R的POD活性最高，且顯著高于2對照材料(P<0.05)，CK2的POD活性最低，CK1居中。(圖3)

CAT活性：各處理間供試紅三葉材料的顯著性如圖3(g)所示。無論是常溫還是低溫脅迫處理，R的CAT活性均顯著高于CK1和CK2(P<0.05)。

圖2 紅三葉材料×低溫脅迫天數交互作用間葉片可溶性糖含量和丙二醛含量的差異Fig.2 Differences of soluble sugar content and malondialdehyde content in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days

圖3 紅三葉材料×低溫脅迫天數交互作用間葉片SOD，POD和CAT活性的差異Fig.3 Differences of the SOD,POD and CAT activities in red clover under the interaction of materials and low temperature stress days

2.4 不同紅三葉材料耐低溫性綜合評價

植物在受到逆境脅迫后，受多種因素的影響[8]。僅依據單項指標不能準確地評價參試紅三葉材料的耐低溫性強弱。故本試驗采用模糊隸屬函數法對參試紅三葉材料的LWC，CHL，SS，MDA含量及SOD，POD和CAT活性7項指標進行耐低溫性隸屬函數值計算(表3)，并通過耐低溫性綜合分析對其進行排序。結果表明，3份供試紅三葉材料的耐低溫性強弱為R > CK1 > CK2。

表3 不同紅三葉材料的抗寒隸屬函數值及耐低溫性排序Table 3 Subordinate function values of low temperature resistance and order for different red clover materials

3 討論

抗寒性鑒定是牧草種質資源評價的重要內容之一。植物的抗寒性由其遺傳特性決定的，是植物長期處于低溫寒冷環境的過程中，通過本身的遺傳變異和自然選擇獲得的一種抗寒能力。不同植物抗寒性不同，甚至同一植物不同器官的抗寒性也不一樣[14]。抗寒性強的植物其LWC含量較低，CHL含量下降的幅度較小，有利于植物對低溫環境的適應性[15]。抗寒性強的苜蓿品種在低溫條件下能夠維持較高的SOD，POD和CAT活性[16]。劉瑞媛[17]研究表明，不同甜高粱均具有一定的抗寒性但其抗寒能力有一定差異。本試驗結果表明，紅三葉新品系的LWC最低，CHL含量及葉片SOD，POD和CAT活性最高，CK1的LWC最高，CK2的SS含量最高，說明在低溫脅迫條件下不同紅三葉材料的各項生理指標表現不一致(表2)，用單一指標難以衡量其耐低溫性強弱。

本研究得出，低溫脅迫21 d時供試紅三葉材料的LWC顯著低于脅迫前，說明植物的耐低溫性和植物的LWC之間存在著緊密聯系。溫度是制約酶活性高低的重要因子之一，當低溫脅迫超過植物體所能承受的能力時光合作用就會受到不可逆傷害，光合作用色素含量也會明顯減少[18]，本研究得出，隨著低溫脅迫程度的加劇，參試紅三葉材料的CHL含量顯著降低，這與王寧[19]的研究結果一致，說明低溫脅迫不但讓植物體葉片葉綠素合成受阻，還會造成葉片葉綠素降解速度的升高，最終使植物葉片CHL含量下降。申曉慧[20]研究得出，抗寒性強的苜蓿材料在冬季最冷月時，SS含量高于其他品種。趙一鶴等[21]研究表明，隨著低溫脅迫時間的延長，3個甜角品種幼苗葉片的LWC呈下降趨勢，MDA含量，Pro含量和SS含量呈上升趨勢。老麥芒和巴旦杏受到低溫脅迫SS含量上升，細胞膜受損傷程度加深[22-23]。本研究得出，隨脅迫時間的延長，供試紅三葉材料的MDA含量和SS含量均呈上升趨勢，說明受低溫脅迫影響，中間產物自由基和MDA，與細胞內各種成分發生強烈地反應，因而引起對酶和膜的嚴重傷害，導致膜的結構、生理完整性及許多生物功能分子的破壞；而SS不但可以提高細胞的滲透濃度，降低水勢，增加植株的持水能力，同時還可以作為冰的保護劑對原生質體和線粒體起保護作用，對提高植物的耐低溫性具有重要作用[24]，這也與前人[21-23]研究結果相符合。

SOD和POD共同作用，將有毒的自由基活性氧還原成水和氧分子，CAT對線粒體和膜脂過氧化產生的活性氧有清除作用。這 3種保護性酶與植物抗寒性密切相關，已被研究所證明[6]。本試驗結果表明，隨著低溫脅迫時間的延長，紅三葉葉片的SOD，POD和CAT活性均表現出先升高后下降的趨勢。是因為細胞中的保護酶系統SOD，POD和CAT通過酶活性的增強，來清除體內有害物質，使細胞免于傷害或抗性加強[22]。這說明適度低溫脅迫對紅三葉具有抗寒鍛煉的效果，但長期重度低溫脅迫則會使植物酶失活，活性降低。

從紅三葉材料與低溫脅迫天數間的交互作用而言，隨著低溫脅迫時間的延長，供試紅三葉材料的LWC呈下降趨勢，并在脅迫21 d時達到最小值。但各材料的變化幅度不同，紅三葉新品系的LWC降幅較大，表明在低溫條件下該品系通過降低體內組織含水量，減少了低溫結冰帶來的傷害[25]。陳代慧等[24]發現，脅迫天數相同時，抗寒性強的山茶花品種CHL含量下降程度要小于抗寒性弱的品種。劉雨詩[26]也認為抗寒性強的紫花苜蓿擁有更高的CHL含量。本研究發現，無論是常溫還是低溫脅迫，紅三葉新品系R的CHL含量均顯著高于CK2，說明紅三葉新品系的耐低溫性較強，這與劉雨詩[26]的研究結果一致。根據參試紅三葉材料在低溫脅迫第14 d的MDA和SS含量的變化，紅三葉新品系的MDA含量顯著低于2對照材料，而SS含量顯著高于2對照材料，隨著脅迫時間的延長至21 d時，CK1的SS含量最高，CK2的MDA含量最低，表明參試紅三葉材料在不同脅迫天數下生理指標的變化各異。

從整個脅迫天數來看，3份紅三葉材料葉片的SOD，POD和CAT活性總體呈先升高后下降的變化趨勢，且紅三葉新品系R的3種酶活性均顯著高于2對照材料，說明在短期低溫脅迫下，參試紅三葉材料產生應激反應，體內SOD，POD和CAT活性增大，以維持細胞膜的穩定性和完整性，抵御逆境，以減輕低溫對植物造成的傷害，但隨著低溫脅迫程度的加劇，膜系統受到的傷害越來越嚴重，致使細胞內的各種代謝出現紊亂，SOD，POD和CAT活性又開始下降，這表明植物抗氧化保護系統的抵抗修復能力有一定閾值[10]。

在紅三葉生長發育過程中，不同材料的耐低溫機制可能不同，因此，為了客觀評價3份紅三葉材料的耐低溫性，需從多個指標進行綜合考慮，而隸屬函數分析則能滿足這一需求，故本試驗采用隸屬函數法進行分析，結果表明R耐低溫性強于CK1和CK2。

4 結論

3個參試材料中，新品系R的LWC和SS含量最低，CHL含量，MDA含量及葉片SOD，POD和CAT活性最高。隨著低溫脅迫時間的延長，供試紅三葉材料的LWC和CHL含量逐漸降低，MDA含量和SS含量則逐漸升高，葉片中SOD，POD和CAT活性均呈先升高后下降的變化趨勢。從紅三葉材料×低溫脅迫天數交互作用而言，R的CHL含量顯著高于CK2，SS含量及葉片SOD，POD和CAT活性均顯著高于2對照材料。基于隸屬函數法的綜合評價表明，紅三葉新品系R耐低溫性最強，其次為岷山紅三葉，甘紅1號紅三葉的耐低溫性最差。