食品中砷和硒生物可給性研究及健康風險/有益性評價

廖文，汪光，李開明，陳中穎

1. 生態環境部華南環境科學研究所，國家環境保護水環境模擬與污染控制重點實驗室，廣州 510655 2. 廣東省水與大氣污染防治重點實驗室，廣州 510655 3. 中國科學院廣州地球化學研究所，廣州 510640

硒(Se)是人體必需的微量元素。研究表明，大米和海鮮類是人體從食品中攝取硒的主要來源[1-2]。然而隨著工業現代化、農村城鎮化和養殖業集約化的發展，人們向環境中排放各種廢水、廢氣和廢渣，導致環境污染日趨嚴重。作為食物鏈最頂端的人類，在從食品中攝取營養的同時，也暴露在污染物的風險中。食品中的有害或有利微量元素從腸道吸收后在體內被運輸至目標組織，產生毒害作用或發揮健康功能[3]。砷(As)是一種類金屬元素，在自然界中普遍存在，其通過污染的水體、食物和空氣經食物鏈進入人體后，隨血液流動分布于全身各組織器官，過量砷暴露或微量砷的長期暴露都會對植物、動物和人體產生毒害作用，進而引發多器官組織和功能的異常變化，導致急性或慢性砷中毒[4-6]。大米作為我國居民的主要膳食組成，其安全性與居民的健康息息相關[7]。調查顯示，我國谷類作物中含砷量為70～830 μg·kg-1，某些砷污染嚴重的地區如湖南郴州，水稻籽粒中砷的含量高達7 500 μg·kg-1，是稻米中砷安全標準推薦值的75倍[8]。因此，大米作為食品砷暴露的主要途徑，越來越受到國內外重視[9-17]。另一方面，砷能夠在海產品中富集，目前不少研究顯示可食性海藻(海帶、紫菜等)、魚類和貝類等海產品中砷的含量較高，長期攝入這些海產品能導致一定的健康風險，可能造成人體砷慢性中毒[18-24]。

生物有效性(bioavailability)是指被人體吸收后進入血液，然后在體內重新分布的污染物或營養物的含量與攝入總量的比例。生物有效性測定一般通過動物或人體活體實驗(invivo)得到，但是實驗周期長、過程難控制[25]，因此，采用體外模擬實驗(invitro)代替，獲得污染物最大經口生物有效性的指示，即生物可給性(bioaccessibility)。生物可給性即污染物或營養物在胃腸環境中可以溶出的比例，基于invitro方法模擬人體消化系統(主要是胃和小腸)，采用與人體生理條件一致或相接近的人工合成消化液(唾液、胃液和小腸液等)來浸提不同基質中的污染物，測定污染物溶出量，得出污染物的生物可給性[26]；該方法操作簡單、實驗周期短、費用低廉、實驗條件易于操作、實驗結果重現性較好，同時得到的生物可給性能夠很好地擬合invivo方法的實驗結果[27]，因此被廣泛地應用。根據實驗過程和消化液成分的不同有不同的invitro方法，主要包括IVG法(InVitroGastrointestinal)、SBRC法(Solubility Bioaccessibility Research Consortium Assay)、DIN法(Ruhr-Universit?t Bochum, Germany)、PBET法(Physiologically Based Extraction Test)和SHIME法(Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystems of Infants)等[28]。其中，生理原理提取法PBET法是基于生理提取來獲得生物可給性的方法，能較好地模擬實際胃腸消化，且步驟簡單，與invivo得到的土壤和食品中砷、鉛和其他微量元素的生物有效數據擬合性較為理想[29]。近年來關于食品中砷的生物可給性方面已有一定的研究基礎[3-4,18,25-32]。但是研究所獲得的結果不一，例如食品中砷的生物可給性為36%～99%，這可能與食品基質以及采用的研究方法不同有關[28]。而關于硒的生物可給性雖有研究，但主要集中在海鮮的研究[33-34]，關于大米的研究仍然較少。目前的研究結果表明，魚肉中硒的生物可給性為50%～83%[33-34]。

本研究對廣州市場上采集的大米和魚肉進行處理后測定砷和硒的濃度，并采用PBET方法模擬胃腸消化后，分析總砷和總硒的生物可給性，最后在此基礎上對食品中砷和硒的健康有益性/風險進行評價，對比初始濃度和生物可給濃度下的健康有益性/風險以及砷的致癌風險，以期為更為準確評估砷及硒的健康風險提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 樣品采集

在廣州市場采集大米樣品共26種，其中，廣東省11種、江西省3種、東北地區6種、四川省3種和廣西壯族自治區3種。采集后的大米樣品自然晾干，用粉碎機粉碎，過60目篩，裝袋密封儲存于干燥器中備用。測定總砷和總硒濃度后選取其中3個濃度梯度的大米進行生物可給性實驗。

在廣州某2個海鮮市場及超市采集鱭魚(廣州南沙，人工養殖)、老虎斑(珠海，人工養殖)和多寶魚(珠海，人工養殖)。采集的魚樣品去皮、骨頭等，清水洗后用超純水沖洗3次，然后絞碎肌肉，于-20 ℃下預冷凍12 h后，一部分放入真空冷凍干燥機(ALPHA 1-2，CHRIST，德國)內冷凍干燥72 h，獲得凍干樣品，另一部分在-80 ℃下保存。

1.2 樣品測定[35]

準確稱取粉碎后的大米樣品0.4 g或取魚肉樣品(未凍干樣品0.5 g；凍干樣品0.2 g)，加入4 mL硝酸靜置直至樣品基本溶于硝酸中(4～6 h)，然后加入1 mL雙氧水，之后使用微波消解儀(Mars6，CEM，美國)在最大功率1 600 W條件下進行梯度消解40 min(各消解溫度下的爬升時間和停留時間分別為120 ℃：6 min，5 min；150 ℃：5 min，5 min；180 ℃：4 min，15 min)。消解液定容至50 mL，采用0.22 μm水系膜過濾后待測。標準物質與空白采用同樣方式消解，每個平行3份樣品。

實驗中砷和硒濃度采用ICP-MS(ICP-MS 7700，Agilent，美國)測定。ICP-MS的工作參數如表1所示。采用碰撞反應池模式，通入氦氣(5 mL·min-1)消除40Ar35Cl的干擾。實驗采用5%硝酸逐級稀釋砷和硒混合標準液，由于食品中砷和硒的濃度很低，砷和硒標準曲線的濃度梯度分別為0.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg·L-1。選用72Ge作為內標(10 μg·L-1)，在線加入。實驗測得砷和硒標準曲線相關系數均在0.9999以上。測定空白樣(5%硝酸)，計算11次測定值的3倍標準偏差所對應的分析物的濃度值，即為檢出限[36]，本研究中計算得到的砷和硒檢出限分別為0.093和0.0022 μg·L-1。

采用大米標準物質(GBW10043)、狗鯊魚肉(NRC DORM-2)和魚蛋白(NRC DORM-4)標準物質(均購自中國國家標準物質研究中心，北京)用于保證方法的準確性，總量測定實驗中，標準物質與其他樣品在相同條件下萃取其中的砷和硒，標準物質的測定值與標準物質中砷和硒的標準含量的比值可得出方法的回收率，分別為82%～115%和91%～107%。

1.3 in vitro生物可給性實驗

食品中砷和硒的生物可給性實驗基于體外模擬胃-腸兩階段消化(PBET)[25]，實驗中所用到的化學物質，除特別說明，均來自Sigma-Aldrich公司，為分析純及以上。實驗用水為超純水(Milli-Q Element，Millipore，美國，電阻率≥18.2 mΩ·cm)，所用到的器皿均采用20%硝酸浸泡24 h后洗凈待用。

每個反應罐中加入500 mL模擬胃液(1 L超純水+1.25 g胃蛋白酶+0.5 g檸檬酸鈉+0.5 g蘋果酸+420 μL乳酸+500 μL乙酸，并用12 mol·L-1的HCl調節pH值至2)，取5 g大米或魚肉凍干樣品，通氬氣1～2 min，開始計時，在37 ℃的溶出試驗儀中以150 r·min-1旋渦震蕩1 h；旋轉條件下取30 mL消化液。在進入腸階段前，先用飽和NaHCO3溶液將pH值調至5.3，然后在每個反應罐中加入0.875 g膽酸鈉(m(食物樣品)∶m(膽酸鈉)=1∶0.175)和0.25 g胰酶(m(食物樣品)：m(胰酶)=1∶0.05)；再用1 mol·L-1的NaOH將pH值調至7.0；在37 ℃的溶出試驗儀中以150 r·min-1旋渦震蕩2 h；旋轉條件下取30 mL消化液。消化液在5 000×g離心15 min，上清液采用0.22 μm水系膜過濾后，采用ICP-MS測定砷和硒。

表1 ICP-MS儀器的工作參數Table 1 ICP-MS instrument parameters

1.4 生物可給性及健康風險計算

根據樣品測定結果，食品中砷和硒的生物可給性可按照以下公式計算[24]：

(1)

為了評價魚肉中砷和硒的健康有益性/風險及砷的致癌風險，采用每日攝入量(EDI)及目標癌癥風險(TR)[37-38]：

(2)

(3)

式中：DC為每日大米或魚肉攝入量(g·d-1)；Ci為大米或魚肉中的砷或硒濃度或者生物可給濃度(μg·g-1)；BW為人的體重(成人60 kg，小孩32.5 kg)[39]。小孩和成人大米攝入量分別為277和389 g·d-1，廣東省成人魚肉攝入量為60 g·d-1，小孩魚肉攝入量為41 g·d-1[39]。EF為暴露頻率(365 d·a-1)，ET是暴露時間(70 a)，AT為平均暴露天數(25 550 d)，CSF為癌癥斜率系數(1.5 (mg·kg-1·d-1)-1)，可接受或可容忍的風險為10-4[38]。

1.5 統計分析

采用SPSS 21.0和OriginLab 9.0分析數據。采用單向方差分析顯著性，當P<0.05，則認為具有顯著性。所有的數據采用平均值或者平均值±標準偏差的形式。所有質量濃度均為干重形式。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 食品中砷的含量和生物可給性

選取的3種大米中砷的平均濃度為0.085、0.121和0.168 μg·g-1。Zhuang等[9]在華南地區采集3種不同品牌大米進行風險評價，市場售賣的大米中砷的濃度為0.086～0.156 μg·g-1，與本研究大米中砷的濃度相似。綠色食品大米標準(NY/T418—2000)中規定砷濃度≤0.40 μg·g-1，從已有樣品的砷含量來看，廣州市場大米總砷含量均滿足綠色食品大米標準。

魚肉中砷的含量較高，鱭魚(大)、老虎斑和多寶魚中砷的平均濃度分別為2.224、4.649和5.533 μg·g-1，根據含水率核算得到濕重下3種魚肉中砷的平均濃度分別為0.433、1.100和1.030 μg·g-1。Zhang等[22]對深圳某海水養殖區的河豚和石斑魚進行檢測，其中肌肉組織中砷的含量(干重)分別為1.04～1.86和2.59～7.85 μg·g-1，與本研究中的多寶魚和老虎斑的結果類似。

來自同一海域的不同的魚體中砷的濃度不一，這可能與不同魚類代謝的方式和程度以及不同棲息和攝食習性等有關。已有研究表明，海水魚中重金屬的平均濃度大于淡水魚[40]，肉食性魚中重金屬的含量大于雜食性和草食性魚[41]。老虎斑是典型的肉食性海魚類，主要攝食魚、蝦、蟹和章魚等海洋生物；多寶魚攝食甲殼類、小魚和蝦等；鱭魚屬河口性洄游魚類。因此，濕重形式下老虎斑濃度最大。

由圖1可知，大米中的砷生物可給性為86.86%～99.34%，而魚肉中砷的生物可給性相對來說較低，為51.95%～75.64%。大米和魚肉中砷的生物可給性相異的原因可能在于砷在不同食品中分布的形態不一樣。研究表明，當食品中無機砷的生物可給性遠遠高于其他形態的砷[30]。Huang等[42]曾報道，無機砷為我國大米中砷的主要形態，占比約為78.3%左右。而水產品(如魚肉)中砷的主要形態為砷甜菜堿，同時有部分的二甲基砷酸鹽[21]。

2.2 食品中硒的含量和生物可給性

大米和魚肉中硒的含量列于表2中。3種大米中硒的含量為0.098～0.190 μg·g-1，高于Chen等[1]的研究中廣東省售賣的大米中硒的平均含量，為(0.0039±0.0018) μg·g-1。而魚肉中硒的含量為1.641～2.315 μg·g-1干重，與其他文獻中關于魚肉硒含量的報道相似[2]。由圖2可知，大米中硒的生物可給性為76.73%～85.44%，而魚肉中硒的生物可給性為71.48%～79.83%。食品中硒的生物可給性也與其化學形態有關。食品中，在大米中硒的主要形態為硒代蛋氨酸(SeMet)，而在魚肉中硒的主要形態為硒代半胱氨酸(SeCys2)[2,43]。Khanam和Platel[34]曾報道，SeMet的生物可給性要大于SeCys2。因此，大米中硒的生物可給性大于魚肉樣品中硒的生物可給性。

對比砷和硒胃生物可給性和胃腸生物可給性的數據發現，相較于胃消化，完成模擬胃腸階段消化后，食品中砷和硒的生物可給性均有所上升(圖1和圖2)。這是因為，在酸性條件下(pH=2.0)，胃蛋白酶接受更多的氫離子使其更好地打破肽鍵，將蛋白質水解。而在腸消化階段，pH調至pH=5.3～7.0，胰液中的酶催化多糖被水解形成單糖，并進一步破壞蛋白質的結構，形成自由氨基酸和縮氨酸，促進了結合在蛋白質上砷和硒的釋放，另一方面膽鹽能增強胰酶的活性。因而在胃腸消化后，砷和硒的生物可給部分更多得以釋放出來[25]。

圖1 大米、魚肉中砷的胃生物可給性、胃腸生物可給性Fig. 1 Gastric and gastrointestinal bioaccessibility of arsenic in rice and fish

圖2 大米、魚肉中硒的胃生物可給性、胃腸生物可給性Fig. 2 Gastric and gastrointestinal bioaccessibility of selenium in rice and fish

表2 大米和魚肉中總砷和總硒的含量及生物可給濃度Table 2 Total contents and bioaccessible concentration of arsenic and selenium in rice and fish

表3 大米和魚肉中砷和硒的每日攝入量(EDI)Table 3 Estimated daily intake (EDI) of arsenic and selenium in rice and fish

2.3 健康有益性/風險評價

所研究的大米和魚肉中總砷和總硒的每日攝入量如表3所示。

以生物可給的濃度計算得到的每日砷和硒攝入量均小于以食品中砷和硒的初始濃度計算得到的值。計算得到每日通過大米和魚肉攝入的硒為0.274～1.025 μg·kg-1，硒在微量情況下對人體有利，其推薦攝入量為最高為55 μg·d-1(即成人和小孩分別為1.69和0.92 μg·kg-1·d-1)[1]，因此，仍需通過膳食調整，使從大米和魚肉攝入的硒來滿足人體需求，尤其對于小孩來說，應該注意硒的適量攝入。大米中無機砷含量約占45%～78.3%[16]，而魚肉中無機砷含量約占總含量的5%[38]，通過公式(2)和(3)，計算得到成人和小孩通過表3中攝入無機砷的致癌風險分別為1.69×10-5～5.81×10-4和2.13×10-4～7.34×10-4，是可接受或可容忍的風險的0.17～7.3倍。因此，盡管通過大米和3種魚攝入的無機砷占國際糧農組織和世界衛生組織(FAO/WHO)公布的無機砷的每周暫定耐受量(PTWI)[6](15 μg·kg-1BW，折算成每日最高暫定耐受量為2.1 μg·kg-1BW)的0.5%～35.7%，但是所研究的大米和魚肉中無機砷的致癌風險較大，尤其是小孩，更易攝入砷產生毒害。

針對廣州市售的大米和魚肉中砷和硒的生物可給性進行了研究，結果表明，大米和魚肉中86.86%～99.34%和51.95%～75.64%的砷生物可給，76.73%～85.44%和71.48%～79.83%的硒生物可給。并在生物可給濃度的基礎上對每日攝入量進行了計算。在廣州，成人和小孩每日通過大米和魚肉攝入的硒為0.274～1.025 μg·kg-1，攝入的砷為0.225～1.017 μg·kg-1，但計算得到成人和小孩攝入無機砷的致癌風險是可接受或可容忍的風險的0.17～7.3倍，日常生活中需要注意減少砷含量較高的海魚以及無機砷較高的大米的攝入，尤其是小孩。但本文只單獨考察了總砷的攝入，無機砷的百分含量是根據文獻估算，下一步應考察無機砷的生物可給性，綜合其他食品中砷的生物可給性以及通過水、土壤等環境介質攝入的砷進行人體砷暴露風險評價。