四環素對微囊藻生長及光合作用的毒性效應機制

董聰聰，張紅波，楊燕君，付君珂，劉黎，賀新宇，施軍瓊，吳忠興

西南大學三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715

四環素類抗生素(TCs)是由放線菌金色鏈叢菌產生的或半合成的一類廣譜抗生素，主要包括四環素(TC)、土霉素(OTC)和金霉素(CTC)等[1-2]，它可以與細菌核糖體30s亞基結合，阻止酰胺-tRNA進入A位點，抑制蛋白質合成，影響細菌生長繁殖[3-4]。從20世紀50年代起，四環素類抗生素作為人類常用抗生素用于醫療行業，因其具有廣譜抗菌性、價格低廉和使用方便等特點，常作為獸藥、飼料添加劑廣泛應用于畜牧業和養殖業[5]。四環素類抗生素作為全球第二大生產和使用的抗生素，每年有數千噸在全球范圍內生產[6-7]。研究已表明，抗生素在人畜體內不能被完全吸收，有30%～90%以尿液、糞便的形式排出體外；同時，四環素具有良好的水溶性，容易通過地表水進入到湖泊、河流等水環境中[8-9]。Hamscher等[10]檢測到在液體糞肥中四環素的含量可達4.0 mg·kg-1；Miao等[11]在對加拿大污水處理情況的長期監測中發現，處理后的污水中仍殘留0.15～0.97 μg·L-1的四環素；在中國北方地區13個陸源入海排污口/河流的水樣檢測中，四環素最高濃度為1.114 μg·L-1 [12]；在廣州魚塘水中四環素含量可達5.16 μg·L-1，檢出率為28.6%[13]；然而，姜蕾等[14]在對長江三角洲地區典型廢水的檢測中發現，養豬場廢水中四環素類抗生素殘留濃度為31.02～100.75 μg·L-1。已有研究表明，四環素能夠降低水生苦草的葉綠素含量，削弱光合作用，抑制苦草的生長[15]。同樣，四環素通過抑制水生動物體內多種酶的活性，對魚類等造成DNA損傷[16]。因此，四環素類抗生素對水生態系統和人體健康的潛在威脅值得關注。而中國目前對于這一問題的研究尚顯不足[17]。

藻類作為初級生產者在水體生態系統的結構和功能中發揮著重要的作用[18]。外源污染物對藻類的毒性作用將直接影響水生食物鏈的能量傳遞，進而對高營養級生物和整個水生態系統產生影響[5]。四環素類抗生素對藻類的毒性試驗表明，四環素類抗生素能夠抑制斜生柵藻和蛋白核小球藻的生長，但由于四環素種類及濃度的差異性，導致其對藻細胞的膜通透性的影響也不盡相同[5]。四環素還能夠抑制銅綠微囊藻的光合作用，破壞抗氧化酶系統，抑制藻類生物量增長[19-20]。光合作用可為植物的生命活動提供物質與能量，是植物生長發育的重要保障[21]。然而，以往的研究多集中于四環素類抗生素對藻類的敏感性、生長情況和抗氧化酶系統的影響等方面，而對光合響應及作用機制等方面的研究較少。因此，以水體常見的水華藍藻——微囊藻(Microcystisaeruginosa)為研究材料，探究不同濃度下四環素對藍藻的生長、光合系統Ⅱ的影響，旨在探究四環素對微囊藻的毒性效應，為揭示四環素對浮游植物的急性毒性作用和致毒機理提供一定的理論依據；同時，對于全面認識四環素類抗生素對淡水藍藻的毒性作用、評價該類物質的生態風險具有現實意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料及培養條件

微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB-905)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。純化后的藻種擴大培養至對數期，接種于含四環素(購自aladdin?，分析純)的MA培養基[22]中，初始接種密度約為1.744×109cells·L-1。結合已有對綠藻和微囊藻的研究[3,5,18]以及預實驗結果，設置各處理組中的四環素濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mg·L-1，以0 mg·L-1作為對照組。每個濃度設置3個重復，培養條件為光強50 μmol photons·m-2·s-1、光照周期12 h L:12 h D、培養溫度(25±1) ℃，每天按時搖動3次，并調換各個培養瓶位置，以保證藻細胞和培養液充分接觸和受光均勻。

1.2 葉綠素a含量和細胞密度的測定

每天取藻液5 mL用于葉綠素a的測定。葉綠素a的提取參照Nush[23]的方法，用90%的丙酮進行抽提，采用紫外分光光度計(UV-1206，Shimadzu)測定微囊藻在663、645、630和750 nm處的吸光值，Chla(mg·L-1) = [11.64×(D663-D750)-2.16×(D645-D750)+0.10×(D630-D750)]×Vt/(V×δ×1000)，Vt為丙酮定容的體積(L)，V為提取所用的藻液體積(mL)，δ為比色皿光程[24]。已有研究表明，微囊藻不同藻細胞密度與680 nm波長的吸光值呈良好的線性關系[25]，由顯微鏡下計數所得的微囊藻細胞數和微囊藻在680 nm處測得的吸光值計算出微囊藻細胞密度(y,107cells·L-1)與680 nm處吸光值(x)的線性方程為y= 1186.1x-42.236,回歸系數R2= 0.9929。每天測定各處理組的OD680值，并根據線性公式計算各處理組的藻細胞密度。比生長速率(μ)根據公式μ= (lnN0-lnN1)/(t1-t0)計算，N0、N1分別表示t1、t0時刻的細胞數。

四環素對微囊藻的半致死濃度(4 d-LC50和7 d-LC50)則采用概率單位法計算[26]，由SPSS22.0(IBM, USA)中的“probit”模型計算得出。由第4天和第7天的細胞數分別計算出0.1、0.2、0.5、1、2和5 mg·L-1濃度下的生長抑制率。以“抑制率”作為“響應頻率”，“觀測值匯總”為“100%”，“對數轉換后的四環素濃度”作為“協變量”，然后，通過SPSS22.0中probit模型進行計算，概率為0.5的對應濃度值即為LC50值。

1.3 微囊藻光合系統Ⅱ(PSⅡ)快速光響應曲線(RLCs)和快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)的測定

RLCs的測定采用PHYTO-PAM浮游植物分析儀(PHYTO-PAM Phytoplankton Analyzer, Walz, Effeltrich, Germany)。測定前，將各處理組藻液暗適應20 min，測定時共設置0、32、64、128、256、384、512、704、960、1216、1 600和1 984 μmol·m-2·s-1共12個水平的光合有效輻射強度，每個光照水平間隔20 s[27]。RLCs曲線的擬合參照Platt等[28]的公式：

rETR = ETRmax·(1-e-aPAR/ETRmax)·e-βPAR/ETRmax

式中：rETR為相對電子傳遞速率；ETRmax為最大相對電子傳遞速率；PAR為光合有效輻射強度；α為RLCs曲線的斜率；β為抑制參數。OJIP曲線的測定是通過植物效率分析儀(Handy-Plant Efficiency Analyzer, Hansatech, UK)進行測定。所有樣品進行測定前暗適應20 min[29]，測定結果以瞬時曲線形式繪制熒光信號，儀器中的JIP-測試(JIP-test)用于對葉綠素a熒光瞬變現象的多相增長進行分析[30]，參數以吸收光能為基礎的性能指數(PIABS)、用于電子傳遞的量子產額(φEo)、最大光化學效率(φPo)、用于熱耗散的量子比率(φDo)、反應中心捕獲的激子中用來推動電子傳遞鏈中超過QA的其他電子傳遞的量子產額(ψo)、單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量(ETo/RC)、單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量(TRo/RC)、單位反應中心耗散掉的能量(DIo/RC)、單位受光面積的反應活性中心數量(RC/CSo)、單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)和從開始照光至到達FM的時間段內QA被還原的次數(N)從JIP測定中計算獲得。

1.4 統計分析

實驗中每組處理設置3個平行，實驗數據統計分析使用SPSS 22.0(IBM, USA)進行One-way ANOVA及LSD多重比較，擬合曲線用軟件Origin 9.0(https://www.originlab.com)進行擬合。“*”表示P<0.05、“**”表示P<0.01，具顯著差異。

2 結果(Results)

2.1 葉綠素a含量和比生長速率(μ)

不同濃度四環素處理下，微囊藻葉綠素a含量變化如圖1(a)所示，結果表明，1.0、2.0和5.0 mg·L-1四環素處理，微囊藻葉綠素a含量顯著低于對照組(P<0.01)，而0.1、0.2和0.5 mg·L-1四環素處理下，微囊藻葉綠素a含量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。隨著四環素濃度的升高，微囊藻的比生長速率顯著下降(圖1(b))，2.0和5.0 mg·L-1四環素處理7 d后，微囊藻的生長被顯著抑制(P<0.01)，其比生長速率數值分別為-(0.186±0.057) d-1和-(0.516±0.080) d-1，而0.1、0.2和0.5 mg·L-1處理組與對照相比無顯著差異(P>0.05)。四環素處理4 d后，微囊藻半致死濃度4 d-LC50為(0.698±0.037) mg·L-1。第7天時，7 d-LC50為(0.571±0.036) mg·L-1。

2.2 快速光響應曲線(RLCs)

PSⅡ快速光響應曲線結果如圖2和表1所示，結果表明，在1.0、2.0和5.0 mg·L-1四環素處理7 d后，微囊藻rETRmax相比于對照組分別降低了44.04%、46.05%和57.52%(P<0.01)；光飽和點(IK)與對照組相比分別下降了17.04%、32.18%和33.55%(P<0.01)。光響應曲線的斜率(α)在四環素濃度為5.0 mg·L-1時表現出明顯差異(P<0.01，表1)。然而，在0.1、0.2和0.5 mg·L-1四環素處理下，rETRmax、IK和α與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。

圖1 不同濃度四環素處理下微囊藻的葉綠素a含量和比生長速率(μ)Fig. 1 Effect of different concentrations of tetracycline on chlorophyll a content and specific growth rate (μ) in Microcystis aeruginosa

圖2 不同濃度四環素處理7 d后微囊藻的快速光響應曲線(RLCs)Fig. 2 Rapid light curves (RLCs) of Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracyclineNote: rETR stands for relative electron transfer rate; PAR stands for photosynthetic active radiation.

2.3 PSⅡ快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)及相關參數

不同四環素濃度對微囊藻OJIP曲線如圖3所示，結果表明，在1.0、2.0和5.0 mg·L-1四環素濃度處理下，微囊藻OJIP曲線的J點顯著升高，而低濃度處理組的OJIP曲線與對照相比無顯著變化。

進一步對JIP測定的葉綠素熒光參數進行分析，結果表明，受四環素的影響，微囊藻RC/CSo顯著下降，且隨四環素濃度增加逐漸下降(P<0.01，圖4(c))。在低濃度處理組(<0.5 mg·L-1)，PIABS、φEo和φPo隨著處理濃度的增加而升高(圖4(a)和圖4(c))，然而，高濃度處理組(>1.0 mg·L-1)中，PIABS、φEo和φPo則隨著處理濃度的增加顯著降低(P<0.05，圖4(b)和圖4(c))。在1.0、2.0和5.0 mg·L-1處理組中，ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC、N和φDo隨四環素濃度的增加而顯著增大(P<0.01，圖4(b)和圖4(c))，然而，ETo/RC、ψo卻隨著四環素的增加顯著降低(P<0.01，圖4(a)和圖4(b))。

表1 不同濃度四環素處理7 d后微囊藻的快速光響應曲線參數Table 1 Parameters of RLCs for responses in Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracycline

注： rETRmax表示最大相對電子傳遞速率，IK表示飽和光強，α表示光合效率。
Note: rETRmaxstands for the maximum relative electron transfer rate;IKstands for the saturation light intensity;αstands for photosynthetic efficiency.

圖3 不同濃度四環素處理7 d后微囊藻的快速葉綠素熒光誘導動力學(OJIP)曲線Fig. 3 Fast fluoresence transient curves of Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracycline

3 討論(Discussion)

四環素類藥物具有較好的水溶性，容易隨雨水沖刷和養殖廢水中進入到水環境中。郭曉等[31]在對梅江流域四環素類抗生素空間分布及其遷移轉化研究中發現，四環素類抗生素從該流域養豬場逐漸遷移到小溪流，并最終匯入干流，使得四環素類抗生素對河流生態系統構成了一定威脅。研究表明，四環素類抗生素對微藻的毒性主要表現在通過抑制蛋白質合成和葉綠體的生成進而抑制微藻的生長[16]。本研究發現，隨著四環素濃度的增大，微囊藻的葉綠素含量和生長受到一定程度的影響。與對照組相比，在1.0、2.0和5.0 mg·L-1高濃度處理組，微囊藻的生長和葉綠素合成均受到抑制(圖1)。這與四環素類抗生素土霉素對鞭金藻光合色素含量影響的研究結果一致[32]，表明高濃度四環素能抑制微囊藻的生長。然而，周旭東[33]對銅綠微囊藻的研究表明，低濃度(0.1～2 mg·L-1)四環素類抗生素對銅綠微囊藻的生長影響較小，當四環素濃度為0.1 mg·L-1時表現出促進作用。本研究中，0.1 mg·L-1的四環素雖然也促進了微囊藻的生長，但促進作用并不顯著。低濃度(<1 mg·L-1)的四環素處理組中，微囊藻的生長和葉綠素含量與對照相比無顯著差異(圖1)，表明微囊藻能夠耐受低濃度的四環素。Kühne等[34]在模擬四環素在水中降解實驗中發現，在室溫、自然光照且通風的情況下，四環素濃度在8 d后下降了約17.9%。因此，推測四環素的降解可能部分稀釋了其對微囊藻的毒性，導致微囊藻的生長未受到顯著影響。

在徐冬梅等[5]的研究中，四環素對蛋白核小球藻和斜生柵藻培養4 d時的LC50分別為17.780和12.870 mg·L-1，而本研究中微囊藻的4 d-LC50值為0.698 mg·L-1，這表明實驗所用的微囊藻對四環素的敏感性要明顯高蛋白核小球藻和斜生柵藻。不同藻種對抗生素的敏感性存在一定的差異[35]，且微囊藻細胞要小于柵藻、小球藻的細胞，細胞表面積大于柵藻、小球藻等藻類[36]，因此，其接觸到四環素的面積也較多，可能是導致其敏感性較高的一個原因。

植物體在一定條件脅迫下，其葉綠體的膜結構受到破壞，葉綠素含量將隨葉綠體膜結構的解體而降低，進而降低植物的光合能力[37]。rETRmax表示光合效率的大小，被用來描述PSⅡ的最大光化學效率和開放氧化反應中心的所占比例[38]。本次研究得到，在四環素濃度>1.0 mg·L-1時，微囊藻的rETRmax隨濃度增加而減小(表1)，表明微囊藻的光合作用受到了抑制，開放反應中心的比例降低，這與OJIP參數中RC/CSo的結果相一致。IK的大小表示植物耐受強光的能力[39]，本研究發現，當濃度高于0.5 mg·L-1時,微囊藻的IK隨濃度增加而減少(表1)，表明在高濃度四環素的脅迫下，微囊藻的耐受強光能力減弱。α是快速光曲線的初始斜率，表示藻的捕光能力[40]，本研究發現，當濃度為5.0 mg·L-1時，微囊藻的α值顯著低于對照(表1)，表明微囊藻在高濃度四環素的脅迫下捕光能力減弱。

藻類光合作用的原初反應與葉綠素熒光緊密相關，葉綠素熒光可以反映光合作用中反應中心、供體側和受體側所處的氧化還原狀態[41-42]。當外界環境條件發生改變時，葉綠素熒光發生相應變化，這可以在一定程度上反映環境因子對植物的影響[43]。在對四環素的研究中發現，對煙草生長發育及光合作用的生態毒性效應呈明顯的劑量-效應關系，并且四環素可以促進煙草生育后期光合參數的提高[44]。性能指數PIABS可以衡量PSⅡ的整體性能，能夠靈敏地反映光合系統的變化[43]。本研究發現，四環素處理后，微囊藻RC/CSo顯著減少(圖4(c))，表明四環素使微囊藻部分反應中心(RCs)失活。有研究表明，RCs數量的減少會推動對光能吸收的調節，以保持光合系統中能量的平衡，并且過多的能量會通過熱能或熒光的形式耗散掉[45-46]，且ABS/RC的升高也與RCs的失活有關[47-48]。在高濃度四環素處理下(>1.0 mg·L-1)，微囊藻的ABS/RC、DIo/RC和ψDo顯著升高(P<0.05，圖4(a)和圖4(b))，表明微囊藻反應中心失活程度升高，使得單位反應中心吸收的光能增大，同時耗散掉的能量也增多。然而，PIABS、φPo、φEo和ETo/RC顯著低于對照組(圖4(a)、圖4(b)和圖4(c))，表明微囊藻用于電子傳遞鏈的量子產額和能量減少，光合作用整體受到抑制[49]，這與光響應曲線中高濃度處理組rETRmax和IK顯著低于對照組的結果相一致，表明較高濃度四環素對微囊藻造成脅迫，超出了其自身調節限度，顯著抑制了微囊藻的光合作用。而在低濃度四環素處理下，微囊藻熒光參數中PIABS和φPo顯著升高，ψDo和DIo/RC隨四環素濃度增加逐漸降低(圖4(a)、圖4(b)和圖4(c))。以上參數變化表明，在低濃度四環素處理下，微囊藻通過降低反應中的熱耗散，增加了用于光合作用的能量配額，提高光合效率以應對四環素脅迫[50]。

圖4 不同濃度四環素處理7 d后微囊藻的快速光響應曲線參數注：φPo表示最大光化學效率，ψo表示反應中心捕獲的激子中用來推動電子傳遞鏈中超過QA的其他電子傳遞的量子產額，φEo表示用于電子傳遞的量子產額，φDo表示用于熱耗散的量子比率，ABS/RC表示單位反應中心吸收的光能，DIo/RC表示單位反應中心耗散掉的能量，TRo/RC表示單位反應中心捕獲的用于還原QA的能量，ETo/RC表示單位反應中心捕獲的用于電子傳遞的能量，N表示從開始照光至到達FM的時間段內QA被還原的次數，RC/CSo表示單位受光面積的反應活性中心數量，PIABS表示以吸收光能為基礎的性能指數。 Fig. 4 Parameters of fast fluoresence transient curves for responses in Microcystis aeruginosa after 7 d-culture at different concentrations of tetracyclineNote: φPo stands for the maximum photochemical efficiency; ψo stands for the quantum yield of the exciton captured by the reaction center to promote other electron transfer in the electron transfer chain that exceeds QA; φEo stands for the quantum yield for electron transfer; φDo stands for the quantum ratio for heat dissipation; ABS/RC stands for the light energy absorbed by the single reaction center; DIo/RC stands for the energy dissipated by the unit reaction center; TRo/RC stands for the energy captured by unit reaction center for reducing QA; ETo/RC stands for the energy captured by unit reaction center for electron transfer; N indicates the number of times that QA is reduced during the period from the beginning of illumination to FM; RC/CSo stands for the number of reaction active centers per unit light receiving area; PIABS stands for the performance index based on absorbed light energy.