雙酚A對紫背浮萍生長和光合色素及抗氧化系統影響

梁杰鋒，馬徐發，李鈺，鄒沈娟，趙博禮，侯杰

華中農業大學水產學院，武漢 430070

雙酚A(bisphenol A, BPA)，學名2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷，主要用于生產聚碳酸酯、環氧樹脂及牙科填充物等化工產品，這些產品廣泛應用于醫療器械、食品罐、嬰兒奶瓶和熱敏紙等商品中[1]。根據相關資料統計：2005年中國BPA年產能為5.8×104t，截至2015年底，中國BPA年產能達到115×104t[2]。BPA可通過食品途徑產生毒性效應，也可通過滲入生態系統間接進入體內[3]。目前BPA在萊州灣和深圳市河流中均被廣泛檢出[4-5]；在日本垃圾滲出液中，BPA檢出濃度高達17.2 mg·L-1[6]。BPA會損傷動物生殖發育、遺傳物質以及免疫系統[7]，增加人體和水生動物的患癌風險[8]。

目前，BPA的毒性效應研究主要集中于動物，對水生植物毒性效應研究相對較少。劉紅玲等[9]的研究表明，BPA對斑馬魚有明顯的毒性作用，96 h-LC50為9.06 mg·L-1，對魚卵有致畸作用。Mihaich等[10]研究發現，高濃度(20、50 mg·L-1)BPA導致浮萍(Lemnagibba)葉片密度和生長量顯著下降，葉面密度和生長速率7 d-EC50分別為20和32 mg·L-1。Pan等[11]的研究表明，低濃度BPA促進擬南芥幼苗鮮重及側根數目的增加，高濃度時顯示抑制作用。水生植物作為水域環境的重要組成部分，能夠為其他生物提供食物和棲息地，在水生生態系統平衡中發揮關鍵作用，開展BPA對水生植物的生態毒性效應研究具有重要意義。紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiza)屬紫萍屬、浮萍科，葉狀體扁平，新個體之間通過短柄相連，具有繁殖快、易培養、能夠從水中富集吸收重金屬和有機污染物及生長周期短等特點，逐漸成為環境科學和生態毒理學方面研究的理想模式材料[12-13]。

本研究以紫背浮萍為研究對象，探究BPA對其生長、光合色素含量、氧化損傷情況、抗氧化酶活性、抗氧化物質含量以及滲透壓調節物質含量的變化特征，探究紫背浮萍在BPA脅迫下，生長與光合作用、氧化損傷及抗氧化系統之間的內在關系，為研究BPA對水生植物的生態毒性機制提供理論依據，旨在為環境內分泌干擾物的生態風險評價提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：紫外可見分光光度計(UV 2350，尤尼柯(上海)儀器有限公司)，臺式高速冷凍離心機(Neofuge 15R，中國力康)，電子分析天平(BSA224S，德國賽多利斯公司)，光照培養箱(GZX-250BSH-Ⅲ，上海新苗醫療制造有限公司)，酶標儀(INFINITE 200，瑞士帝肯公司)。

試劑：雙酚A(BPA)(≥99%，Sigma-Aldrich公司)，二甲亞砜(DMSO)(分析純，上?；瘜W試劑公司)，葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)、總抗氧化能力(T-AOC)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽(GSH)、可溶性糖含量和可溶性蛋白試劑盒(購自于南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗材料

紫背浮萍采自華中農業大學校內池塘，將浮萍浸泡于10%的NaClO和0.1% HgCl22 min除菌，再使用無菌水沖洗后用1/10 Hogland營養液擴大培養4周[14]。

1.3 實驗設計

按照經濟合作與發展組織(OECD)化學品測試準則中的浮萍急性毒性測試法進行，BPA試劑配制以DMSO為助溶劑，體積濃度為0.1%，對照組加入等量助溶劑[15]。取室內擴大培養后葉片完好、大小相近的1 g浮萍隨機放入裝有滅菌1 L的1/10 Hogland培養液的燒杯中，培養液和燒杯均進行過高溫滅菌，分別添加5個濃度BPA，即0(對照)、1、5、20和50 mg·L-1，每個濃度設置3個平行。紫背浮萍放置于(25±1) ℃光照培養箱中，光暗比為16 h L∶8 h D，光照強度為7 000 lux，2 d更換一次培養液[16]，7 d后測定紫背浮萍相關生理生化指標。

1.4 實驗指標測定方法

1.4.1 紫背浮萍生長測定

實驗結束后，用吸水紙迅速吸干紫背浮萍表面水分，用電子分析天平稱量其濕重。

1.4.2 光合色素含量及抗氧化系統指標測定

葉綠素、H2O2、MDA含量，抗超氧陰離子自由基、SOD、POD、CAT、T-AOC、APX和GR活性以及GSH含量的測定均嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.4.3 紫背浮萍滲透壓調節物質含量測定

可溶性糖和可溶性蛋白含量測定嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.5 數據處理

數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 21.0統計分析軟件，在P=0.05的置信水平對紫背浮萍生理生化指標的變化情況進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Graphpad prism 6.01軟件繪圖(在以下各柱形圖中，*表示與對照組相比，P<0.05)。

2 結果(Results)

2.1 BPA對紫背浮萍濕重的影響

不同濃度BPA暴露后，與對照組相比，20 mg·L-1組濕重顯著增加(P<0.05)，50 mg·L-1組濕重顯著降低(P<0.05)，其余2組無明顯變化(圖1)。

2.2 BPA對紫背浮萍光合色素含量的影響

紫背浮萍光合色素含量變化如圖2所示，1和5 mg·L-1暴露組的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量顯著高于對照組(P<0.05)，20 mg·L-1組葉綠素a和總葉綠素含量顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3 BPA對H2O2含量、抗超氧陰離子自由基活性和MDA含量的影響

如圖3所示，與對照組相比，5、20和50 mg·L-1暴露組的H2O2含量顯著降低(P<0.05)，所有BPA處理組的抗超氧陰離子自由基活性顯著低于對照組(P<0.05)。與對照組相比，20和50 mg·L-1暴露組MDA含量顯著升高(P<0.05)。

2.4 BPA對紫背浮萍抗氧化酶活性的影響

紫背浮萍抗氧化系統響應如圖4所示，與對照組相比，BPA處理組的CAT活性顯著降低(P<0.05)，5、20和50 mg·L-1暴露組POD活性顯著降低(P<0.05)，所有BPA處理組的SOD和GR活性均顯著降低(P<0.05)，20和50 mg·L-1暴露組的總抗氧化能力顯著降低(P<0.05)。

圖1 雙酚A(BPA)對紫背浮萍濕重的影響注：*P<0.05表示與對照組相比差異顯著；下同。Fig. 1 The effect of bisphenol A (BPA) on fresh weight of Spirodela polyrrhizaNote: *P<0.05, compared with the control; the same below.

圖2 BPA對紫背浮萍光合色素含量的影響Fig. 2 The effect of BPA on the photosynthetic pigments contents of S. polyrrhiza

2.5 BPA對紫背浮萍GSH含量的影響

紫背浮萍GSH含量變化如圖5所示，與對照組相比，5、20和50 mg·L-1暴露組GSH含量顯著增加(P<0.05)。

2.6 BPA對紫背浮萍滲透壓調節物質的影響

紫背浮萍滲透壓調節物質含量如圖6所示，與對照組相比，20 mg·L-1組可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)。5、20和50 mg·L-1暴露組組可溶性蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

3.1 BPA對紫背浮萍生長和光合色素含量的影響

植物光合作用、抗氧化系統以及滲透壓調節物質在植物生長和發育過程中扮演重要角色。綠色植物通過利用太陽能，同化二氧化碳和水制造有機物并釋放氧氣，促進自身生長。20 mg·L-1組濕重顯著增加，可能是BPA參與細胞內信號轉導，發揮類似細胞分裂素的作用，誘導植物生長[17]。50 mg·L-1組濕重顯著降低，可能是由于高濃度的BPA抑制了細胞的分裂，抑制紫背浮萍的生長[18]，這與Xu等[19]和Qiu等[20]的研究結果基本一致。Xu等[19]研究發現，低濃度BPA暴露導致玉米幼苗根長、鮮重和干重增加，但高濃度BPA暴露后，鮮重和干重明顯降低；Qiu等[20]用含有BPA的溶液來培養大豆，發現低濃度BPA有促進生長的作用，而高濃度的BPA抑制大豆生長。

圖3 BPA對丙二醛(MDA)含量、H2O2含量和抗超氧陰離子自由基活性的影響Fig. 3 The effects of BPA on the malondialdehyde (MDA), H2O2 contents and antisuperoxide aninon activity of S. polyrrhiza

Jiao等[21]研究發現，低濃度的BPA通過促進葉綠素合成來影響大豆幼苗的光合作用，從而對植物生長產生影響，本研究中1 mg·L-1組、5 mg·L-1組和20 mg·L-1組的光合色素含量顯著升高。有研究表明，高濃度的BPA可以降低葉綠素的含量，干擾植物的正常生理活動，對有機物積累過程產生影響[22-23]。本研究中50 mg·L-1組光合色素含量低于對照組，表明BPA可能通過影響光合色素含量對植物的生長產生效應[24]。

3.2 BPA對紫背浮萍抗氧化系統的影響

有研究表明,植物在生長過程中遇到惡劣環境，自身產生大量活性氧(ROS)致使氧化還原反應失衡，植物體內活性氧存在形式主要包括H2O2、·OH以及超氧陰離子(·O2-)，過多的ROS會引起細胞內脂、蛋白質和DNA等的氧化損傷，誘發氧化應激[25]。隨著BPA濃度增加，H2O2含量和抗超氧陰離子活性降低，BPA暴露組與對照組之間有顯著差異，說明紫背浮萍在BPA脅迫情況下，體內·O2-增加，導致抗超氧陰離子自由基活性降低，H2O2降低可能是體內去除活性氧的系統發揮了作用。MDA是植物體內重要的膜脂過氧化產物，Movafeghi等[26]研究發現，紫背浮萍在Zn暴露后，MDA含量顯著增加，膜系統受損。本研究中，20 mg·L-1組和50 mg·L-1組MDA含量在暴露組中顯著增加，表明高濃度BPA暴露時，活性氧誘導氧化損傷，造成膜脂過氧化，對植物的正常生理活動產生危害[27]。

圖4 BPA對紫背浮萍抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)的影響Fig. 4 The effects of BPA on the activities of aseorbateperoxidase (APX), catalase (CAT), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), glutathione reductase (GR), and total antioxidant capacity (T-AOC) in S. polyrrhiza

圖5 BPA對紫背浮萍谷胱甘肽(GSH)含量的影響Fig. 5 The effect of BPA on glutathione (GSH) content in S. polyrrhiza

植物體內存在抗氧化系統維持植物中ROS含量的平衡[28]。SOD能清除·O2-，并催化·O2-形成O2和H2O2的歧化反應；CAT主要存在于細胞過氧化物酶體中，可將H2O2轉化為O2和H2O；POD廣泛存在于植物的不同組織中，是反映植物生長發育、體內代謝狀態和對外界環境適應性的標志；APX以H2O2作為氧化劑并催化單脫氫抗壞血酸(MDHA)形成；GR在去除ROS對植物氧化應激反應中起關鍵作用；T-AOC能夠反映植物體內的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總水平。GSH是植物體內重要的抗氧化物質，可以減少重金屬對植物的損傷和羥基自由基的形成[29]。BPA暴露后的CAT、SOD和GR活性均顯著降低，在5、20和50 mg·L-1

圖6 BPA對紫背浮萍可溶性糖和可溶性蛋白的影響Fig. 6 The effect of BPA on soluble sugar and soluble protein content in S. polyrrhiza

暴露組POD和T-AOC活性均顯著降低，APX活性出現下降趨勢，但與對照組相比沒有顯著差異，GSH含量在5、20和50 mg·L-1組顯著增加，可能是由于BPA暴露后活性氧含量升高，導致抗氧化酶的活性降低，這與其他學者的研究結果基本一致：Xu等[30]研究發現，紫背浮萍在鐠暴露后，抗氧化酶活性降低，GSH含量增加；Parlak等[31]的研究表明，紫背浮萍隨著納米二氧化鈦含量的升高，CAT與POD活性顯著降低。紫背浮萍可能通過激活各種酶和非酶抗氧化劑來減輕BPA誘導的氧化損傷，抗氧化酶活性和抗氧化物質含量的變化反映出紫背浮萍抗氧化系統在BPA脅迫后的復雜變化。

3.3 BPA對紫背浮萍滲透壓調節物質的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是調節植物滲透壓的關鍵物質，有助于植物適應外界環境的脅迫。有研究表明，苧麻葉片的可溶性糖和可溶性蛋白含量在鎘(Cd2+)處理后呈現增加趨勢進而來抵御不良環境的影響[32]，本研究中，20 mg·L-1組可溶性糖含量顯著升高，5、20和50 mg·L-1暴露組可溶性蛋白含量顯著高于對照組。紫背浮萍可能通過提高可溶性糖和可溶性蛋白含量，提高滲透調節能力，減輕BPA對于自身的毒性[33]。

綜上所述，低濃度BPA提高紫背浮萍光合色素含量，促進有機物質積累，濕重逐漸增加；BPA濃度升高，植物光合色素含量降低，光合作用降低，有機物質積累較慢，活性氧積累，造成氧化損傷，抗氧化酶體系發揮作用，膜脂過氧化發生，植物滲透壓調節物質受到影響，植物生長受到抑制。