銅污染草地對放牧烏蒙半細毛羊礦物質元素代謝的影響

霍賓，吳婷，肖華，申小云,,3,*

1. 西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽 621010 2. 貴州師范大學國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴陽 550025 3. 中國西南世界銀行扶貧項目貴州辦公室，貴陽 550004

烏蒙半細毛羊產業是烏蒙山區的支柱產業，是該區少數民族賴以生存和發展的物質基礎，具有產毛量高、肉用性能好、早熟、耐粗飼和適應性強等特點，在烏蒙山區草地生態畜牧業發展中起到了關鍵作用[1-2]。烏蒙半細毛羊是利用本地綿羊(藏系山谷型粗毛羊)導入肉毛兼用的考力代、新疆半細毛羊和林肯羊等半細毛羊血液雜交育成的毛肉兼用型羊種，經1974—1982年的級進雜交，1982—1990年的橫交固定，1990—2007年的擴群推廣已經形成一個生產性能較好、遺傳性能相對穩定的綿羊育種群[3]。從2007年開始，筆者團隊在現有研究基礎上開展烏蒙半細毛羊的進一步培育工作，到2017年已經育成生產性能優秀、遺傳性能穩定的綿羊新品種，其各項生產性能都明顯高于當地其他品種，在烏蒙山區草地生態畜牧業發展中起到了關鍵的作用，是當地牧民群眾生產生活資料的主要來源。

重金屬污染是指由重金屬或其化合物對環境造成的污染[4-6]。重金屬具有致癌、致畸及致突變作用，嚴重威脅人體健康和食品安全。重金屬難以分解，不但對生物體造成直接傷害，還沿食物鏈富集，危害整個生態系統[4-5]。隨著現代工業的發展，重金屬對環境的污染日益嚴重，給人們的生產、生活和身心健康帶來了極大危害[5-8]。烏蒙山區氣候溫暖濕潤，冬無嚴寒，夏無酷暑，擁有豐富的飼料資源，發展草地畜牧業具有得天獨厚的自然條件，也是我國西部礦產資源的聚寶盆。近年來，由于國民經濟和社會的快速發展，對各種礦產資源的需求高速增長，開采規模不斷增加，礦山加工企業如雨后春筍般蓬勃發展，產生的污染物大量排放，導致生態環境嚴重破壞，此外，污染還通過食物鏈富集危害動物和人類的健康[8-9]。重金屬銅污染是烏蒙山區主要污染形式之一，污染區域土壤和牧草的銅含量嚴重超標，部分區域達到正常含量的3～5倍，同時伴有鎘、鉛和鋅等元素的污染[9-10]。對草地畜牧業和人類健康造成了嚴重的影響，對烏蒙半細毛羊產業的影響尤為明顯。為了尋找銅污染草地無害化利用的技術和方法，減少銅污染對烏蒙半細毛羊產業的影響，筆者開展了銅污染草地對放牧烏蒙半細毛羊礦物質元素代謝影響的研究。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗設計

1.1.1 放牧試驗

隨機選擇1歲的烏蒙半細毛羊公羊18只，體重(35±2.5) kg，臨床檢查健康。試驗組：在赫章縣媽姑鎮選擇12 hm2的銅污染草地，試驗前經初步分析土壤有機質含量為8.3%～12.8%，pH為6.04±0.23，銅含量為(72.45±18.33) μg·g-1；牧草銅含量(15.35±8.47) μg·g-1，用圍欄分為相等的2個部分，每部分放牧6只烏蒙半細毛羊。對照組：在威寧縣涼水溝選擇6 hm2的無污染草地，試驗前經初步分析土壤有機質含量為7.9%～11.5%，pH為6.23±0.35，銅含量為(16.15±1.23) μg·g-1；牧草銅含量為(5.13±0.73) μg·g-1，放牧6只烏蒙半細毛羊。實驗組和對照組均為自然放牧，放牧試驗時間為2017年4月20日至2017年6月20日，共60 d。

1.1.2 礦物質補充試驗

放牧試驗結束時，在赫章縣媽姑鎮銅污染草地放牧的12只烏蒙半細毛羊隨機分為2組(處理Ⅰ、處理Ⅱ)，繼續在銅污染牧場放牧。處理Ⅰ：補充飼喂硫酸鈉(Na2SO4)，每只羊10 g·d-1，連續補充15 d，飼喂方式為分別在早晨和傍晚各稱取5 g Na2SO4，按照硫酸鈉∶玉米面為1∶20的質量比例調和后投喂；處理Ⅱ：不做任何處理。

1.2 樣品的采集

1.2.1 土壤樣品的采集

試驗開始時，分別在姑媽鎮和涼水溝的試驗草地采集土壤樣本。隨機采集0～20 cm的表層土壤樣品30個(試驗組每個處理10個，共20個；對照組10個)。樣品在l m×l m的樣方中采集，各樣方間隔100 m，每個樣方采集1個，每個樣本200 g，用于分析重金屬元素含量，標記采樣點，為同地點采集牧草樣品做準備。

1.2.2 牧草樣品的采集

試驗開始前，分別在姑媽鎮和涼水溝的試驗草地采集混合牧草樣本。隨機采集混合植物樣品30個(試驗組每個處理10個，共20個；對照組10個)，為減少不同牧草品種對礦物質含量的影響，以土壤樣品采集點為圓心，選擇離圓心100 m，均勻分布的10個點(每個點相互間隔200 m)，每個點采集20 g牧草，10個點牧草混合組成1個200 g的牧草樣品，為了減少土壤污染，采集離地0.1 cm以上的牧草部分。

1.2.3 血液樣品及肝活體組織采集

試驗結束時，用真空采血管采集頸靜脈血液10 mL，血液溫度降到室溫后，8 h內低溫4～8 ℃運回實驗室做進一步的研究和分析。肝臟活體組織采集，由操作熟練的專門技術人員采用肝臟穿刺術采集，采集后的樣本固定于標本瓶內，同血液一起低溫送回實驗室[11]。

1.3 樣品的處理

采用微波消解法，利用微波加熱封閉容器中的消解液，在高溫增壓條件下使各種樣品快速溶解。土壤、牧草在室溫下晾干至恒重，土壤過200目篩，用硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)和氫氟酸(HF)(體積比5∶2∶5)混合液微波加熱溶解樣品，牧草和動物組織用硝酸和高氯酸(體積比4∶1)混合液微波加熱溶解樣品[12]。

1.4 分析測試

1.4.1 重金屬元素的檢測

分析土壤、牧草和動物組織的重金屬元素含量應用電感耦合等離子體原子發射光譜法(Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectroscopy, ICP-AES)[12]。使用儀器為電感耦合等離子體發射光譜儀(HK9600 Type Atomic Emission Spectroscopy, Huaketiancheng Co., Ltd, China)。分析的元素種類為錳(Mn)、鋅(Zn)、鈷(Co)、銅(Cu)、鐵(Fe)、磷(P)、鉬(Mo)和硒(Se)。

1.4.2 血液指標的檢測

用動物專用全自動血細胞分析儀(Automatic Blood Cell Analyzer, Sysmex Poch-100i Veterinary, Japan)檢測血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、紅細胞數(red blood cell count, RBC)、紅細胞壓積(packed cell volume, PCV)、平均紅細胞體積(mean corpuscular volume, MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin, MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)和白細胞數(white blood cell count, WBC)[2]。用生化試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱苷肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、銅藍蛋白(ceruloplasmin, Cp)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、磷酸肌酸激酶(creative phosphokinase, CPK)和天門冬氨酸氨基轉移酶(glutamic oxaloacetic transaminase, GOT)。

1.5 數據分析

研究數據整理分析應用SPSS軟件(version 22.0 for Windows; Chicago, Illinois, USA)，數據用獨立樣本t檢驗來估測各處理間的差異顯著性(P<0.05、P<0.01，Student’st-test)。

2 結果(Results)

2.1 銅污染草地放牧試驗

2.1.1 銅污染草地土壤和牧草礦物質元素含量

銅污染草地土壤和牧草銅含量顯著高于對照組(P<0.01)。土壤和牧草鋅的含量顯著高于對照組(P<0.05)。其他元素沒有明顯的差異，如表1所示。

2.1.2 銅污染對動物血液和肝臟礦物質含量的影響

銅污染草地放牧動物(試驗組)血液銅和鋅的含量顯著高于對照組(P<0.01)，鉬和鐵的含量顯著低于對照組(P<0.05)。銅污染草地放牧動物(試驗組)肝臟銅和鋅的含量顯著高于對照組(P<0.01)，鉬和鐵的含量顯著低于對照組(P<0.05)。其他元素沒有顯著的差異，如表2所示。

2.1.3 銅污染對動物的血液指標的影響

銅污染草地放牧動物(試驗組)Hb、PCV、RBC和MCV顯著低于對照組(P<0.01)。其他指標無顯著差異，如表3所示。試驗組SOD、CAT和GSH-Px顯著低于對照組(P<0.01)，Cp、MDA、CPK和GOT顯著高于對照組(P<0.01)，如表3所示。

2.1.4 銅污染對羊毛產量、品質和羊體重的影響

試驗組產毛量、羊毛的長度顯著低于對照組(P<0.01)。對凈毛率和細度沒有顯著的影響。銅污染草地放牧，對羊生長速度和羊毛銅含量有顯著的影響，試驗組體重平均增重量顯著低于對照組(P<0.01)，試驗組羊毛平均銅含量顯著高于對照組(P<0.01)，如表4所示。

2.2 動物礦物質補充試驗

硫元素補充對產毛量、凈毛率、細度和長度均無顯著影響。對生長速度也沒有顯著的影響，在整個試驗期間，處理Ⅰ組平均增重量(3.78±0.13) kg，處理Ⅱ組平均增重量(3.97±0.12) kg，對羊毛銅含量沒有顯著的影響，處理Ⅰ組羊毛平均銅含量(8.79±0.72) μg·g-1，處理Ⅱ組羊毛平均銅含量(8.58±0.81) μg·g-1。

2.2.1 補充硫對血液礦物質含量的影響

同試驗開始時比較，試驗結束時處理Ⅰ組銅含量顯著降低(P<0.01)，同時顯著低于處理Ⅱ組(P<0.01)，處理Ⅰ組鉬含量同試驗開始時比較明顯降低(P<0.01)，但同處理Ⅱ差異不明顯；處理Ⅱ組血液銅含量繼續明顯增加(P<0.01)，明顯高于處理Ⅰ組(P<0.01)，處理Ⅰ組鉬含量明顯降低(P<0.01)，其他元素無明顯差異，如表5所示。

表1 土壤和牧草礦物質元素含量Table 1 The mineral content in soil and forage (μg·g-1)

注：同行上標不同小寫字母表示相同指標與對照組比較差異顯著(P<0.05)，同行上標不同大寫字母表示相同指標與對照組比較差異顯著(P<0.01)，下同。
Note: With different small letter superscripts within a line indicate significant differences at 0.05 level as compared with the control; with different capital letter superscripts within a line indicate significant differences at 0.01 level as compared with the control. The same below.

表2 放牧烏蒙半細毛羊血液和肝臟中礦物質元素含量Table 2 The mineral content in blood and liver of semi-fine wool sheep (μg·g-1)

表3 銅污染草地對放牧烏蒙半細毛羊血液指標的影響Table 3 Effect of copper pollution meadow on hematological values of semi-fine wool sheep

注：Hb、RBC、PCV、MCV、MCH、MCHC和WBC表示血紅蛋白、紅細胞數、紅細胞壓積、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白含量、平均紅細胞血紅蛋白濃度和白細胞數；SOD、CAT、GSH-Px、Cp、MDA、CPK和GOT表示超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱苷肽過氧化物酶、銅藍蛋白、丙二醛、磷酸肌酸激酶和天門冬氨酸氨基轉移酶。
Note: Hb, RBC, PCV, MCV, MCH, MCHC and WBC stand for hemoglobin, red blood cell count, packed cell volume, mean corpuscular volume, mean corpuscular hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin concentration and white blood cell count; SOD, CAT, GSH-Px, Cp, MDA, CPK and GOT stand for superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, ceruloplasmin, malondialdehyde, creative phosphokinase and glutamic oxaloacetic transaminase.

表4 銅污染對羊毛產量和品質的影響Table 4 Effect of copper pollution meadow on the yield and quality of wool

表5 補充硫對血液礦物質元素含量的影響Table 5 Effect of sodium sulfate supplement on mineral contents of blood (μg·g-1)

2.2.2 礦物質元素補充對動物血液指標的影響

礦物質元素補充試驗結束時，處理Ⅰ組Hb、PCV、RBC和MCV顯著高于處理Ⅱ組(P<0.01)，同時也顯著高于試驗開始時(P<0.01)。WBC無明顯差異；處理Ⅱ組Hb、PCV和RBC顯著低于試驗開始時，并出現溶血性貧血，如表6所示。

2.2.3 補充硫對肝臟礦物質含量的影響

礦物質元素補充試驗結束時，處理Ⅰ組肝銅含量基本達到正常范圍，顯著低于補充試驗開始時(P<0.01)，同時明顯低于對照組(P<0.01)，肝臟鉬含量明顯低于補充試驗開始時(P<0.01)。處理Ⅱ組在補充試驗完成時，肝臟銅含量明顯高于試驗開始時(P<0.01)，肝臟鉬的含量明顯低于試驗開始時(P<0.05)。其他元素無明顯差異，如表7所示。

3 討論(Discussion)

重金屬污染已成為世界各地關注的焦點，重金屬污染治理方法和機理研究是環境科學領域的研究重點[13-15]，充分利用元素間的相互作用降低重金屬污染對動物的影響是治理重金屬污染的有效措施之一[16-21]。銅污染草地放牧，顯著增加了血液和肝臟的銅含量，動物出現溶血性貧血，嚴重影響了動物的生長發育。在硫元素補充試驗中，通過硫和銅的相互作用，有效降低了血液和肝臟的銅含量，但對生長發育沒有明顯的改善，筆者認為，硫補充試驗只有15 d，動物還在中毒狀態的恢復中，如果開展長期的試驗一定會有效改善試驗動物生長狀況，但進一步的研究亟待開展。

3.1 銅污染草地放牧對血液和肝臟礦物質含量的影響

烏蒙半細毛羊是烏蒙山區的主要畜種，其棲息地重金屬污染十分普遍[20-23]。動物組織的重金屬主要來自土壤和牧草，引起動物重金屬中毒的原因主要包括2個方面：一是牧草重金屬含量太高所引起動物組織重金屬含量超標；二是元素間相互作用引起的某些元素過剩[22-25]。在研究中，銅污染草地土壤和牧草銅含量顯著高于對照組(P<0.01)，同時也顯著高于正常范圍，通過食物鏈對放牧動物造成嚴重的危害，引起血液和肝臟銅的含量明顯高于對照組，試驗組動物肝臟銅含量是對照組的4.2倍，肝臟是動物貯存銅的主要器官，銅含量高可損傷肝細胞核、線粒體及肝漿液的亞細胞結構，從而引起肝功能異常[26-28]。

表6 補充硫對血液指標的影響Table 6 Effect of sodium sulfate supplement on hematological values

表7 補充硫對肝臟礦物質元素含量的影響Table 7 Effect of sodium sulfate supplement on mineral contents in liver (μg·g-1)

3.2 銅污染草地放牧對動物血液指標的影響

試驗結束時，銅污染草地放牧動物的Hb、PCV和RBC顯著低于對照組(P<0.01)，MCV顯著低于對照組(P<0.05)，出現溶血性貧血。當血液銅明顯升高時，肝臟從血液中攝取大量的銅，如果超過其耐受限度，則可抑制多種酶的活性、導致肝細胞變性壞死，排銅功能障礙，當肝臟銅濃度過高，又大量釋放銅進入血液，然后進入紅細胞，胞內銅濃度不斷升高，從而降低紅細胞中谷胱甘肽濃度，使紅細胞脆性增加而發生管內溶血，溶血時，腎銅濃度升高，腎小管被血紅蛋白阻塞，腎單位壞死，導致腎功能衰竭和血尿[29-34]。如肝細胞能再生并足以吸收已死亡肝細胞所釋放的銅，則臨床不表現癥狀和溶血，即使肝內銅含量很高也是如此。如肝細胞不能有效再生，將促使銅快速進入血液，血漿銅水平升高，紅細胞大量破壞發生溶血，溶血反過來又加速肝壞死，釋放更多的銅進入血液，周而復始，引起溶血性貧血[26,33,35]。

3.3 銅污染草地放牧對羊毛品質和產量的影響

試驗組產毛量、羊毛的長度顯著低于對照組(P<0.01)。硫是動物最主要的營養元素之一，也是蛋白質的主要組成部分[34]。羊毛包括鱗片層、皮質層和髓質層，主要成分是蛋白質，因此羊毛的生長需要大量的硫。在研究中，土壤和牧草的銅含量顯著高于正常需要量，在反芻動物的瘤胃、血液和肝臟中的銅都能明顯影響硫吸收和利用，高銅的飼料將引起動物硫缺乏，影響羊毛的產量將是必然結果[1-2]。

3.4 硫補充對動物組織和血液指標的影響

無論必需元素，還是非必需元素，當它們在動物體內大量蓄積時，都會對組織和器官產生毒性[32,36-37]。為了避免其毒性作用，動物有抑制攝入、隔離和增強排出等聯合調節機制，另外還可以通過調控金屬結合蛋白，從而防止或減輕其毒性，逐漸達到解毒的目的[27,38-40]。但重金屬間的相互作用也是降低重金屬對機體影響的主要措施，硫、鉬和銅存在復雜相互關系，在腸道，硫和鉬形成硫鉬酸鹽封閉吸收銅的部位，降低銅吸收。在血液中銅-鉬-硫蛋白復合物較穩定，銅不易為組織所利用[41-43]。在肝臟中，硫鉬酸鹽能直接將銅從金屬硫蛋白上剝離下來，剝離后的銅以小分子物質進入血液和膽汁，金屬硫蛋白則又從其他蛋白上將銅轉移補充，然后再剝離，這樣循環，最終使動物銅貯備逐漸減少，最終降低血液銅含量，減少銅污染的毒性[44-47]。在筆者的研究中通過補充硫酸鈉達到了降低肝銅和血銅的目的，補充試驗結束時，動物血液指標恢復了正常。