離子選擇性微電極用于外界脅迫下細胞液中鈣分布檢測的新模式

邵海玲，徐長山，張海嬌，喬金，鄭博文，何慧敏

東北師范大學紫外光發射材料與技術教育部重點實驗室，長春 130024

離子選擇性微電極是一種電化學傳感器，其工作原理是利用能斯特(Nernst)方程將測得的電位值與離子活度進行轉換，從而得到細胞內外的離子活度(濃度)值[1]。同時，也可以通過測量胞外空間離子的濃度梯度，間接得到離子流信息[2-5]。離子選擇性微電極具有非損傷性、測量迅速、靈敏度高、測量范圍廣并且可以進行連續動態測量等優點[6-7]，目前已被廣泛應用于醫學、生物學和環境科學等多個領域[8-10]。

離子選擇性微電極技術的應用中也存在一定的局限性。一方面，在測量細胞外離子濃度梯度時，由于胞外離子濃度差別微小，與之對應電位信號的差別通常小于1 μV[12]，因此，在測量的過程中，必須進行嚴格的電磁屏蔽。另一方面，在測量胞外空間離子濃度梯度時，需要精確控制電極尖端反復移動的距離。操作起來難度較大，對電極微操作系統要求較高。如果要測量細胞內特定位置的離子濃度，則要將電極扎進細胞內并在細胞內精確定位。因為細胞膜具有一定的彈性，所以操作具有很大的難度。尤其對于體積較小的細胞來說，電極很難扎進細胞內。因此，尚未見到利用離子選擇性微電極測量細胞內離子濃度分布的研究報道。

筆者在用鈣離子選擇性微電極研究納米粒子對蘆薈原生質體的毒性時，偶然發現原生質體破裂時，由于胞內離子的突然釋放，會產生很強的離子濃度脈沖信號。通過將蘆薈原生質體置于低滲液中，有意使其吸水脹破，確認了這一脈沖信號的存在。以往的研究者應當也觀察到過這種脈沖信號，不過可能只是把它當成實驗中的偶發現象忽略了，沒有給予足夠的重視。通過分析發現，該信號可以定性地反映細胞液內離子的分布情況(定量的反演分析尚在進行中)。在此基礎上，筆者又對低溫、CuO NPs、鋱、鎘和乙醇脅迫下，蘆薈原生質體破裂時形成的Ca2+濃度脈沖信號進行了檢測和分析，發現了一些新現象，初步揭示了低溫脅迫、CuO NPs、鋱、鎘和乙醇處理對細胞液內Ca2+分布的不同影響。

相對于以往的離子選擇性微電極應用模式而言，本文的方法具有以下優點：其一是抗干擾能力強。原生質體破裂時，其外部Ca2+濃度變化可以達到2個數量級，脈沖信號明顯，受外界干擾影響小。其二是操作簡單、不需要精確控制電極的移動。因為在實驗過程中，只需要將微電極的尖端靠近原生質體，而不需要在微米量級上往復移動電極，也不用擔心在操作微電極控制器時產生的回程差問題，操作較簡單。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 蘆薈原生質體

本文研究對象是蘆薈(Aloevera)細胞的原生質體，它不但保留了完整細胞的一切活性特征，而且可以方便地通過低滲液使其脹破產生離子濃度脈沖信號。

原生質體用酶解法從蘆薈的葉肉中提取，過程如下：將0.400 g纖維素酶(>15 000 U·g-1，國藥集團化學試劑有限公司)、0.280 g果膠酶(1.18 U·g-1, Sigma Aldrich)、2.186 g甘露醇(≥80.5%，中國惠世生化試劑有限公司)、0.040 g磷酸二氫鉀(KH2PO4) (≥99.5%，北京化工廠)、0.222 g二水合氯化鈣(CaCl2·2H2O)(≥98%，西隴化工有限公司)加入20 mL去離子水混合，放入磁力攪拌器(CL-2，鞏義市予華儀器有限公司)攪拌20 min，再將混合液放入低速離心機(DT5-6，北京現代北利離心機有限公司)，2 000 r·min-1離心8 min，取上清液即為酶解液，備用；選取健康蘆薈葉片肥厚部分，用酒精和去離子水反復沖洗消毒去除表皮和膠質部分并再次用去離子水清洗。將3 g剝好的葉片放入盛有20 mL酶解液的燒杯中，用保鮮膜封口后，用黑色塑料袋包裹，放入溫度20 ℃、轉速60 r·min-1的恒溫培養振蕩器(ZWYR-240，上海智誠分析儀器制造有限公司)中震蕩酶解約4～5 h后取出燒杯，用200目細胞濾網過濾，得到蘆薈原生質體。

將制備好的原生質體移入培養基中培養，培養基的配比為2.186 g甘露醇、0.040 g KH2PO4、0.222 g CaCl2·2H2O和20 mL去離子水。

為了降低培養基中Ca2+對實驗結果的影響，在進行Ca2+濃度脈沖檢測之前，將蘆薈原生質體用無鈣培養基(在原培養基配方中去掉CaCl2·2H2O)清洗3～5遍。

1.2 納米氧化銅懸浮液的配制

用分析天平(XS205DU，瑞士)稱取5.000 mg的CuO NPs(粒徑為40 nm，Macklin，上海)加入100 mL的去離子水中，水浴超聲(KQ-250DB，350 W,昆山市超聲儀器有限公司)30 min得到100 mL濃度為50 mg·L-1的納米氧化銅懸浮液。

1.3 硝酸鋱溶液的配制

稱取12.000 mg的硝酸鋱(Tb(NO3)3)(99.9%, Strem Chemicals)加入500 mL的去離子水中，配制成濃度為24 μg·mL-1的硝酸鋱溶液。

1.4 氯化鎘溶液的配制

將500 mL的去離子水加入到盛有5.000 mg的氯化鎘(CdCl2)(99%，山東西亞化學股份有限公司)的燒杯中，配制成10 mg·L-1的氯化鎘溶液。

1.5 鈣離子選擇性微電極

1.5.1 鈣離子選擇性微電極制備

鈣離子選擇性微電極由玻璃電極、Ag/AgCl絲、電解液(10-1mol·L-1的CaCl2溶液)和離子交換劑(LIX)組成[16]。其制備過程包括玻璃管(B150-110-10，外徑1.5 mm，內徑1.10 mm，長度10 cm，Sutter Instrument)拉制、硅烷化、LIX吸入和電解液灌充等幾個步驟。詳細制備過程可見參考文獻[17-18]，此處不再贅述。

1.5.2 離子選擇性微電極性能檢測

分別配制10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol·L-1的CaCl2標定液。用制備好的鈣離子選擇性微電極依次對不同濃度的標定液進行測量(甘汞電極做參比電極)，并記錄標定液濃度及其對應的電位值。繪制電極的工作曲線，確定電極的能斯特斜率和檢測下限。此外還對電極的響應時間以及穩定性進行了檢測。

圖1表明電極的R值為0.99965，Nernst斜率是26.9，由此可計算出電極的轉換效率為93.7%>90%；電極的檢測下限優于10-5mol·L-1；在24 h內的電位值基本保持穩定；電極響應時間均小于1 s。

1.6 低溫處理蘆薈原生質體

將清洗過的原生質體分為4份，其中一份放在室溫下正常培養作為對照組。另外3份原生質體放入培養管中，放入冰箱內分別冷凍15、30和90 min后取出。其中冷凍15 min的原生質體懸浮液處于冰水混合狀態，懸浮液的溫度為0 ℃。冷凍30和90 min的蘆薈原生質體懸浮液此時已經是完全結冰狀態，懸浮液溫度分別為-1 ℃和-6 ℃。將取出的裝有冷凍原生質體的培養管置于室溫下解凍作為實驗組。

1.7 CuO NPs處理蘆薈原生質體

從對照組吸取0.1 mL的蘆薈原生質體加入裝有10 mL濃度為50 mg·L-1的CuO NPs懸浮液的培養管中，輕輕搖勻。靜置10、30和60 min后測量。

1.8 硝酸鋱處理蘆薈原生質體

采取相同的方法，將0.1 mL對照組的蘆薈原生質體加入裝有10 mL濃度為24 μg·mL-1的硝酸鋱溶液的培養管中，輕輕搖勻。靜置10、30和60 min后測量。

1.9 氯化鎘處理蘆薈原生質體

同樣，從對照組吸取0.1 mL的蘆薈原生質體加入裝有10 mL濃度為10 mg·L-1的CdCl2溶液的培養管中，輕輕搖勻。靜置10、30和60 min后測量。

1.10 乙醇處理蘆薈原生質體

將3 mL的蘆薈原生質體加入到裝有5 mL 95%乙醇溶液的培養管中，搖勻后靜置40 min待測。

1.11 蘆薈原生質體破裂時Ca2+脈沖信號的測量

鈣離子選擇性微電極和甘汞電極(232型，上海羅素科技有限公司)均固定在三維操縱儀(PTW-4，成都儀器廠)上。微電極尖端的位置可通過倒置顯微鏡(CPX 41, Olympus)觀察。離子選擇性微電極的輸出信號經高阻微電極放大器(SWF-1D,成都儀器廠)放大后，由多道生理信號采集處理系統(RM6240B,成都儀器廠)采集，最后由電腦記錄并顯示。

圖1 鈣離子選擇性微電極性能檢測注：(a)能斯特斜率檢測結果圖，(b)電極檢測下限，(c)24 h內電極電位的變化，(d)電極響應時間曲線圖。Fig. 1 Detection of the performance of the calcium ion selective microelectrodeNote: (a) The test result of the Nernst slope, (b) Lower limit of detection, (c) Changes of electrode potential within 24 h, (d) Response time of the electrode.

將一只10 mL空白培養皿置于倒置顯微鏡的操作臺上，調節三維操縱儀的同時在倒置顯微鏡下觀察，使離子選擇性微電極的尖端盡可能接近培養皿底部。甘汞電極尖端置于距離微電極尖端約1.5 cm處。

吸取50 μL待測原生質體懸液滴入裝有10 mL低滲液(濃度為55 mg·L-1的甘露醇溶液)的培養管中，輕輕搖勻后倒入顯微鏡操作臺上的培養皿中。調節顯微鏡操作臺，使視野中僅出現一個清晰、外形圓潤飽滿的蘆薈原生質體。此時再次微調三維微操縱儀，使微電極的尖端靠近原生質體，直至電極尖端與細胞膜的距離約為5 μm時停止(各次測量均在這一距離上進行，以保證測量條件的一致性)。關閉屏蔽網拉門，系統開始連續記錄電極尖端處的Ca2+濃度。

為了降低外界環境震動和電磁干擾對測量的影響，需將倒置顯微鏡、三維微操縱儀以及微電極放大器的前級置于防震臺上的屏蔽網中。

2 結果(Results)

2.1 對照組的Ca2+濃度脈沖信號

圖2是對照組蘆薈原生質體破裂時所產生的Ca2+濃度脈沖信號(以電極電位表示，下同)。從圖中可以看出，原生質體未破裂前，其附近的Ca2+濃度一直穩定在背景濃度上，沒有什么變化。但在原生質體破裂時，其周圍的Ca2+濃度在很短的時間內(不到10 s)急劇上升，達到一個峰值后，又緩慢下降至背景濃度，形成一個脈沖信號。

2.2 低溫冷凍對Ca2+濃度脈沖信號的影響

吸取前述經冷凍處理15 min并解凍至室溫的蘆薈原生質體懸液50 μL，滴入低滲液中進行測量。圖3是其破裂時Ca2+釋放所產生的脈沖信號。從圖中可以看出，此時的Ca2+濃度雖然也有快速上升，但是上升到峰值所用的時間大約為17 s，明顯長于對照組。

圖2 對照組蘆薈原生質體破裂時產生的Ca2+濃度脈沖Fig. 2 Ca2+ pulse signal of a breaking control-group Aloe vera protoplast

圖3 冷凍處理15 min的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號Fig. 3 Ca2+ pulse signals of a breaking Aloe vera protoplast cooled for 15 min

當溫度降至0 ℃以下時，低溫處理對Ca2+脈沖信號的影響開始變得非常顯著。圖4、圖5是將蘆薈原生質體冷凍30 min和90 min至完全結冰狀態后取出,在室溫下解凍并繼續保存5 min、45 min、23 h和25 h后，所測得的Ca2+濃度脈沖信號。從圖4(a)和圖5(a)可以看出，與在對照組中觀察到的單純的脈沖信號不同，冷凍30 min和90 min后的蘆薈原生質體，其Ca2+濃度脈沖信號的前沿處出現了一個明顯的凹陷。這表明，原生質體周圍的Ca2+濃度先急劇下降，然后才在較短時間內上升到峰值，最后又緩慢下降趨于背景濃度。經30 min和90 min冷凍的樣品，在解凍后23 h(圖4(c))和25 h(圖5(d))后，脈沖前沿處的凹陷消失。

圖4 冷凍30 min，解凍不同時間的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號注：(a)～(d)中解凍時間分別為5 min、45 min、23 h和25 h。Fig. 4 Ca2+ pulse signals of a breaking Aloe vera protoplast of different thawing time after 30 min freezingNote: (a)～(d), thawing time is 5 min, 45 min, 23 h and 25 h.

2.3 CuO NPs處理對Ca2+濃度脈沖信號的影響

圖6是將0.1 mL的蘆薈原生質體加入10 mL濃度為50 mg·L-1的CuO NPs懸浮液中分別處理10、30和60 min后測得的原生質體破裂時Ca2+濃度脈沖信號的波形圖。與對照組圖2比較可以看出，經過CuO NPs處理后，原生質體破裂過程中，在脈沖前沿處都出現了Ca2+濃度下降的現象，并且在60 min內，隨著處理時間的增加，該下降現象就越明顯。

2.4 硝酸鋱處理對Ca2+濃度脈沖信號的影響

為探究重稀土元素鋱對原生質體破裂時的Ca2+濃度脈沖信號是否有影響，將0.1 mL的蘆薈原生質體加入10 mL濃度為24 μg·mL-1的硝酸鋱溶液中，圖7是分別處理10、30和60 min后測量得到的Ca2+濃度脈沖信號?？梢钥闯觯浵跛徜執幚淼奶J薈原生質體在破裂時，其Ca2+脈沖信號的前沿處均出現了凹陷現象，并且當處理時間為30 min時，凹陷程度最大。

圖5 冷凍90 min，解凍不同時間的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號注：(a)～(d)中解凍時間分別為5 min、45 min、23 h和25 h。Fig. 5 Ca2+ pulse signals of a breaking Aloe vera protoplast of different thawing time after 30 min freezingNote: (a)～(d), thawing time is 5 min, 45 min, 23 h and 25 h.

2.5 氯化鎘處理對Ca2+濃度脈沖信號的影響

筆者還利用該方法研究了重金屬元素鎘對細胞液中Ca2+濃度分布的影響。圖8是蘆薈原生質體用10 mg·L-1的CdCl2溶液分別處理10、30和60 min后測量得到的Ca2+濃度脈沖信號?？梢钥闯觯朔N情況下，Ca2+脈沖信號的前沿處同樣都出現了小幅度的凹陷現象。

2.6 乙醇處理對Ca2+濃度脈沖信號的影響

用測量Ca2+濃度脈沖的方法研究了乙醇處理對蘆薈原生質體的影響。將3 mL的蘆薈原生質體加入到5 mL 95%乙醇溶液中處理40 min后測量Ca2+濃度脈沖信號，結果如圖9所示。可以看出，經乙醇處理的蘆薈原生質體在破裂時，其Ca2+濃度脈沖信號的前沿處沒有發生凹陷現象。

3 討論(Discussion)

從圖2可以看到，未經任何處理的對照組原生質體在破裂時產生的Ca2+濃度信號，是一個先急劇上升后緩慢下降的脈沖型信號。這與原生質體破裂時突然釋放出其細胞液中的Ca2+，并且釋放的Ca2+隨時間的推移逐漸向周圍擴散的過程相一致。同時可看到，這是一個單純的脈沖信號，沒有疊加其他的細節。這表明，正常蘆薈原生質體內細胞液中的Ca2+濃度分布較為均勻，沒有大的起伏。

當將原生質體冷凍至不同溫度時，其Ca2+濃度脈沖信號的波形會發生不同程度的變化。當冷凍至0 ℃時，基本波形未變，只是Ca2+濃度脈沖信號的前沿變緩，如圖3所示。這表明，細胞液中Ca2+的分布仍然均勻，但Ca2+的流動性略有降低。

圖6 CuO NPs處理不同時間后的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號注：(a)～(c)中處理時間分別為10、30和60 min。Fig. 6 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplast after treatment with CuO NPs at different timesNote: (a)～(c), the treatment time is 10, 30 and 60 min.

圖7 硝酸鋱處理不同時間后的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號注：(a)～(c)中處理時間分別為10、30和60 min。Fig. 7 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplast after treatment with Tb(NO3)3 at different timesNote: (a)～(c), the treatment time is 10, 30 and 60 min.

圖8 氯化鎘處理不同時間后的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號注：(a)～(c)中處理時間分別為10、30和60 min。Fig. 8 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplast after treatment with CdCl2 at different timesNote: (a)～(c), the treatment time is 10, 30 and 60 min.

圖9 乙醇處理后的蘆薈原生質體破裂時Ca2+的脈沖信號Fig. 9 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplasts after ethanol treatment

當冷凍至-1 ℃和-6 ℃時，Ca2+濃度脈沖的波形發生了很大的變化，其前沿處出現了一個明顯的凹陷(圖4和圖5)。

在整個測量過程中，原生質體是處在低滲液中的，水會通過細胞膜滲透進原生質體中。如果原生質體內的Ca2+不能很快擴散進這些新滲入的水中，則在原生質體中靠近細胞膜處便會形成一個Ca2+的低濃度區。當原生質體破裂時，就會在脈沖的前沿處出現一個與低濃度區相對應的凹陷。

在對照組中未觀察到這種凹陷。這說明，對于正常的蘆薈細胞原生質體，細胞液中的Ca2+具有很好的流動性，能夠很快地擴散到新滲入原生質體內的水中，使細胞液中Ca2+的濃度分布保持均勻，或者說正常的原生質體對其細胞液中的Ca2+具有很好的調控能力。

當原生質體的溫度降至0 ℃時，雖然脈沖前沿變緩，但Ca2+在細胞液中的分布仍然是均勻的。這說明，此時細胞液中的Ca2+仍然具有比較好的流動性，或者說原生質體對于Ca2+分布的調控能力并沒有受到明顯的影響。只是當原生質體破裂時，Ca2+在低滲液中的擴散速度變慢了。

當溫度降到-1 ℃和-6 ℃時，如圖4(a)和圖5(a)所示，Ca2+濃度脈沖的前沿處才出現了明顯的凹陷。這說明，此時原生質體對細胞液中Ca2+的分布失去了調控能力，Ca2+的流動性明顯變差，已經無法快速擴散進新滲入的水中，也無法使Ca2+的濃度保持均勻。此時細胞液中的Ca2+濃度分布出現了分層現象。靠近原生質體中心的Ca2+濃度較高，而向外靠近細胞膜附近的Ca2+濃度較低。

在研究低溫對植物的影響時，人們比較關注植物形態和生理指標的變化[19]。在有關細胞冷凍保存和復蘇的研究中，注意力往往集中在低溫導致植物細胞內的水結冰時，冰晶對細胞造成的機械損傷，而較少注意到冷凍對細胞液內Ca2+濃度分布的影響。本文的結果則表明，冷凍會對細胞調控細胞液中Ca2+濃度分布的能力造成損害，使得細胞液內Ca2+的流動性變差，進而造成細胞液內的Ca2+濃度分布出現分層。這一點是今后研究細胞的冷凍保存與復蘇時應當注意的。

為了研究冷凍造成的細胞液中Ca2+濃度分布的分層現象是否能夠恢復，對解凍后保存不同時間的蘆薈原生質體進行了測量。從圖4和圖5可以看出，在經過較長時間的室溫保存后，原生質體中的Ca2+濃度分布可以得到恢復。并且冷凍處理的時間越長，溫度越低，恢復所需的時間也越長。冷凍90 min的原生質體，Ca2+濃度分層現象得到恢復所需要的時間比冷凍30 min的原生質體要長約2 h。

筆者還嘗試用測量Ca2+濃度脈沖的方法研究了CuO NPs對蘆薈原生質體中Ca2+濃度分布的影響。用CuO NPs分別處理蘆薈原生質體10、30和60 min，結果表明，Ca2+濃度脈沖信號的前沿處均發生了凹陷現象，并且隨著處理時間的增加，該凹陷程度變大(圖6)。這說明CuO NPs也會在一定程度上損害原生質體對內部Ca2+濃度分布的調控能力，降低原生質體內Ca2+的流動性，進而引起細胞液中原生質體內Ca2+的濃度分布產生分層現象。并且在60 min內，隨著處理時間的增加，分層現象越明顯。

有研究表明，CuO NPs會破壞細胞膜的通透性[20]，影響酶的活性等[21]。筆者在研究中也發現，經CuO NPs處理后的蘆薈原生質體變得比較脆弱，容易發生破裂。所以本文只對經CuO NPs處理60 min后的原生質進行了檢測。

鋱作為重稀土元素，有關其毒理效應的報道較少，筆者用同樣的方法測量經硝酸鋱處理過的蘆薈原生質體破裂時Ca2+濃度脈沖信號，發現其脈沖前沿處同樣出現了凹陷(圖7)，并且當處理時間為30 min時，此凹陷程度尤為明顯。這表明，硝酸鋱也會對細胞液調控其內部Ca2+濃度分布的能力造成損傷。繼續測量發現經硝酸鋱處理的時間大于60 min后，蘆薈原生質體破裂時Ca2+濃度脈沖信號與處理60 min時的波形幾乎一致。

重金屬鎘會破壞鈣穩態，并引發細胞損傷或死亡[22]。而研究發現，經氯化鎘處理的蘆薈原生質體破裂時Ca2+濃度脈沖信號的前沿處也出現了小幅度的凹陷現象(圖8)，并且此波形凹陷程度與處理時間長短無關。這表明，氯化鎘會影響原生質體對內部Ca2+濃度分布的調控能力，從而引起細胞液內Ca2+的濃度分布發生輕微的分層。

與上述處理結果不同，經乙醇處理的蘆薈細胞原生質體在破裂時，其Ca2+濃度脈沖信號的前沿處沒有發生凹陷現象(圖9)，這說明，乙醇處理并不會影響細胞液中Ca2+的流動性，也不會出現Ca2+濃度分層現象。

綜上，本文提出了一種離子選擇性微電極用于單細胞檢測的新模式，即利用離子選擇性微電極對原生質體破裂時產生的離子濃度脈沖信號進行測量，進而分析細胞液內的離子濃度分布情況。用這一方法對經過低溫冷凍、CuO NPs、硝酸鋱、氯化鎘和乙醇處理的蘆薈細胞原生質體進行了測量和分析，得到了一些新的有意義的結果。這一新的模式為研究細胞液中的離子濃度分布提供了新的方法，也可為各種環境和生態毒理學評價提供新的途徑。