氧化石墨烯遺傳毒性的實驗研究

韋慧，吳超權，夏星，鐘振國,*

1. 廣西中醫藥大學科學實驗中心，南寧 530200 2. 廣西食品藥品檢驗所，南寧 530021

石墨烯(graphene)是由碳原子以sp2雜化方式形成的納米晶體，是一種蜂窩狀單層二維平面結構的新型納米材料[1]。氧化石墨烯(graphene oxide, GO)是一種石墨烯的含氧衍生物，與石墨烯相比較，GO具有較大的表面積，良好的水分散性，更好的生物相容性，更強的表面活性[2]。GO獨特的物理特性，使其在光電子[3]、太陽能電池[4]、水處理[5]、醫學[6]、環境能源[7]及功能材料[8]等多個領域具有潛在的發展前景。GO能夠廣泛應用的重要前提是其具有可靠的生物安全性，而目前GO在生產、使用或廢棄時進入自然環境后，是否存在生物安全性尚有爭議。大多數研究者認為GO對細菌有毒性作用，但是在細胞和生物整體水平的毒性研究還存在分歧。GO與生物體之間的相互作用還不甚明確，如毒性、炎癥反應、病理變化和體內清除等尚未有一致的結果[9]。GO的潛在致癌和致畸作用的評估，是對其安全性評價中極為重要的一環。已有研究發現，GO的遺傳毒性指數表現為各種類型的染色體畸變，表現出劑量和時間依賴性，特別是在GO暴露時間長、劑量高時，染色體畸變顯著增加[10]。但是目前對GO的遺傳毒性的研究仍較為匱乏。筆者根據《納米毒理學與安全性研究方法》[11]，選用了Ames試驗、體外CHL細胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗進行GO的遺傳毒性研究，考察其潛在的致突變作用，為GO的安全使用提供依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

氧化石墨烯(GO)棕黑色溶液，生產批號D160330C2A。由常州第六元素材料科技公司提供。取GO樣品于121 ℃下高壓滅菌30 min，無菌操作下加入超純水稀釋成相應濃度后超聲2 h制備成穩定的水分散液，現配現用。

胰蛋白胨(批號：3206105)、瓊脂粉(批號：3206098)均購自廣東環凱微生物科技有限公司；D(+)-生物素(批號：20171123)、L-組氨酸(批號：20171013)和牛肉浸膏(批號：20171023)均購自國藥集團化學試劑有限公司；凍干型S9混合液(批號：3480)購自Molecular Toxicology公司；1640培養基(批號：8118264)、胎牛血清(FBS)(批號：1620769)購自Gibco公司；Hank’s液(批號：20170623)、0.25%胰蛋白酶(批號：20170505)和吉姆薩染液(批號：20161229)均購自北京索萊寶科技有限公司；絲裂霉素(MMC)(批號：12/2017)、環磷酰胺(批號：12/2017)和秋水仙堿(批號：12/2017)均購自Roche公司；其他試劑為國產分析純試劑。

1.2 實驗儀器

HERAcell 150i型CO2培養箱(Thermo Scientific)；DM500型倒置相差顯微鏡(LEICA)；Infinite M200 PRO型酶標儀(瑞士帝肯)；AC-4S1型生物安全柜(ESCO Class II BSC)；HH-8型電熱恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；Neofuge23R型低溫高速離心機(Heal Force)。

1.3 實驗菌株

選用鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA-97a、TA-98、TA-100和TA-102進行試驗。菌株均來源于中國典型培養物保藏中心，由廣西食品藥品檢驗所提供。按照試驗要求，這些菌株經過組氨酸需求試驗、結晶紫敏感試驗、抗氨芐青霉素試驗、抗四環素試驗、紫外線敏感試驗和自發回變試驗鑒定，菌株基因型均符合試驗要求。37 ℃震蕩培養16 h，計數生長細菌不少于1×109cells·mL-1活菌方可使用。S9為體外代謝活化系統。

1.4 實驗細胞

CHL細胞，來源于中國科學院昆明細胞庫，由廣西食品藥品檢驗所提供。完全培養液為含10%小牛血清的1640，置37 ℃、5% CO2培養箱孵育。

1.5 實驗動物

SPF級昆明雄性小鼠，體質量18～22 g，由廣西食品藥品檢驗所提供。實驗動物許可證號：SYXK(桂) 2017-002。小鼠飼養于廣西食品藥品檢驗所SPF動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度55%±15%，換氣次數10～20 次·h-1。

1.6 實驗方法

1.6.1 Ames試驗

將0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL GO溶液和0.5 mL S9混合液(當需要代謝活化時)混合，混勻后倒入底層培養基平板上。設0.080、0.040、0.020、0.010和0.005 mg·mL-15個劑量組，同時設自發回復突變和陽性突變劑對照組，陽性對照藥物如表1所示，每組3個平行皿，37 ℃培養48 h，計數各平板菌落數并算出均值，重復試驗一次。

1.6.2 染色體畸變試驗

根據前期用MTT法測GO對CHL的細胞毒性時發現，GO對細胞的半數抑制濃度，-S9組為0.415 mg·mL-1，+S9組為0.767 mg·mL-1。故+S9組加入1.000、0.500和0.250 mg·mL-1GO，而-S9組加入0.50、0.250和0.125 mg·mL-1GO，陰性對照(1640)和陽性對照(+S9：環磷酰胺0.020 mg·mL-1、-S9：絲裂霉素0.001 mg·mL-1)。置于CO2培養箱中培養24 h。終止培養前加入秋水仙堿(0.001 mg·mL-1)處理2 h。制片程序依次為：胰蛋白酶液消化；離心；低滲液低滲；固定液固定，離心；重復1次；滴片；干燥；10% Giemsa染色。各組觀察100個中期分裂相細胞，計數其染色體畸變率。

1.6.3 小鼠骨髓細胞染色體畸變試驗

將小鼠按體質量隨機分為7組，每組10只。根據前期試驗測得GO對小鼠的半數致死量(LD50)為6.364 mg·kg-1。分別設置為1.000、0.500、0.250和0.125 mg·kg-1GO共4個劑量組，同時設陰性對照和陽性對照組(環磷酰胺40 mg·kg-1)，每周尾靜脈注射(i.v.)一次，小鼠于28 d處死。各組動物處死前4 h腹腔注射秋水仙素(4 mg·kg-1)。處死后，取股骨，制備骨髓細胞染色體標本。每一處理組每只動物選擇100個分散良好的中期分裂相細胞進行分析，分別記錄各組染色體畸變類型和數目，計算畸變率。

1.7 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。統計描述采用x±s，多組間比較采用單因素方差分析，率間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 GO的表征

圖1 氧化石墨烯(GO)的表征((a)：TEM；(b)：FTIR)Fig. 1 Characterization of graphene oxide (GO) ((a): TEM; (b): FTIR)

表1 Ames試驗陽性對照藥物Table 1 The positive control drug in Ames test

2.2 Ames試驗檢測GO的致突變作用

計算同一菌株同一劑量組的3個平行培養皿上的平均菌落數和標準差(表2)，結果顯示：無論是否添加S9活化體系，GO各劑量組對TA-97a、TA-98、TA-100和TA-102菌株的回變均無顯著影響，各菌株回復突變菌落數均在正常范圍內；各劑量組與陰性對照組的回復突變菌落數比較差異不顯著(P>0.05)，并且顯著地低于陽性對照組的回復突變菌落數(P<0.01)，Ames試驗結果均呈陰性。

2.3 GO對CHL細胞的致突變作用

經S9活化體系處理(+S9)的GO染色體畸變結果如表3所示，通過卡方檢驗進行比較分析發現，隨GO濃度的增加，CHL細胞染色體畸變率也升高，有明顯的劑量-反應關系。其中，GO的+S9劑量組(1.000 mg·mL-1)與陰性對照組相比，畸變率顯著升高(P<0.05)。

表2 GO的Ames試驗結果Table 2 Ames test results of GO

注：-S9表示平皿中沒有添加S9，+S9表示平皿中添加S9；與陰性對照組比較，**為差異顯著(P<0.01)。
Note: -S9means S9was not added in the petri dish, and +S9means S9was added in the petri dish; compared with the negative control group, ** showed a significant difference (P<0.01).

注：與陰性對照組比較，*為差異顯著(P<0.05)。
Note: Compared with the negative control group, *showed a significant difference (P<0.05).

未經S9活化體系處理(-S9)的GO染色體畸變結果如表4所示。隨GO濃度的增加，CHL細胞染色體畸變率也升高，有明顯的劑量-反應關系。其中，0.500 mg·mL-1劑量組與陰性對照組相比，畸變率顯著升高(P<0.05)。

GO致CHL細胞染色體畸變類型如圖2所示。染色體的斷裂，可進一步造成染色體的缺失或各種重排，由此而產生的染色體結構異常稱為染色體結構畸變。正常CHL細胞染色體未見明顯突變(圖2(a))；1.000 mg·mL-1GO組出現染色體斷裂(圖2(b))；0.500 mg·mL-1GO組出現染色體粉碎化(圖2(c))；0.125 mg·mL-1GO組出現染色體缺失(圖2(d))；陽性組出現染色體交換、多倍體及環狀染色體(圖2(e))。染色體結構畸變觀察表明，GO引起的染色體畸變類型主要為斷裂和缺失。

2.4 GO對小鼠骨髓細胞染色體的致畸變作用

骨髓細胞染色體畸變試驗結果如表5所示。通過卡方檢驗進行比較分析發現，1.000 mg·kg-1劑量組細胞畸變率與陰性對照組相比，畸變率顯著升高(P<0.01)，0.500 mg·kg-1劑量組細胞畸變率顯著高于陰性對照組(P<0.05)。0.250和0.125 mg·kg-1劑量組細胞畸變率均略高于陰性對照組，但與陰性對照組的差異不顯著(P>0.05)。

圖2 GO致CHL細胞染色體畸變圖注：(a). 陰性對照組CHL細胞染色體；(b). 1.000 mg·mL-1 GO組染色體斷裂；(c). 0.500 mg·mL-1 GO組染色體粉碎化；(d). 0.125 mg·mL-1 GO組染色體缺失；(e). 陽性組染色體交換、多倍體、環狀染色體；Giemsa染色，×100。Fig. 2 Chromosome aberration diagram of CHL cells induced by GONote: (a). normal CHL cell chromosome; (b). 1.000 mg·mL-1 GO group chromosome break; (c). 0.500 mg·mL-1 GO group chromosome pulverization; (d). 0.125 mg·mL-1 GO group chromosome deletion; (e). positive group chromosome exchange, polyploidy and circular chromosome; Giemsa staining, ×100.

表4 GO對CHL細胞染色體畸變的影響(-S9，24 h)Table 4 Effect of GO on chromosomal aberrations in CHL cells (-S9, 24 h)

注：與陰性對照組比較，*為差異顯著(P<0.05)。
Note: Compared with the negative control group, * showed a significant difference (P<0.05).

表5 GO對小鼠骨髓細胞染色體畸變率的影響Table 5 Effect of GO on chromosome aberration rate of mouse bone marrow cells

注：與陰性對照組比較，*為差異顯著(P<0.05)，**為差異顯著(P<0.01)。
Note: Compared with the negative control group, *showed a significant difference (P<0.05); *showed a significant difference (P<0.01).

GO致小鼠骨髓細胞染色體畸變類型如圖3所示。陰性對照組小鼠骨髓細胞染色體未見明顯畸變發生(圖3(a))；1.000 mg·kg-1GO組出現染色體缺失(圖3(b))；0.500 mg·kg-1GO組出現染色體斷裂(圖3(c))；環磷酰胺組出現染色體粉碎、交換和多倍體染色體(圖3(d))。染色體結構畸變觀察表明，GO所致染色體畸變類型以染色體斷裂為主。

3 討論(Discussion)

GO獨特的理化性質及其與生物體相互作用特性為其提供了廣泛的應用前景，它的安全性評價成為研究的熱點[12]。目前，關于GO毒性的研究主要集中在其細胞毒性方面。大量體外研究發現，GO通過以下幾種途徑產生毒性：通過與細胞膜脂質雙層的相互作用或由于生物分子的吸附而產生的間接毒性；產生活性氧物質或直接物理毒性，促進細胞毒性；由于疏水表面，石墨烯可以與細胞膜脂質顯著相互作用，引起細胞毒性[13]。此外，GO的細胞毒性與其自身的物理化學性質(大小、形狀和表面官能團等)、作用的細胞種類以及作用濃度等有著密不可分的關系[14]。Zhang等[15]通過放射性元素給GO做標記，并使用放射性示蹤法研究小鼠體內的GO的代謝和分布。注射10 mgkg-1GO到小鼠后發現，其通過血液循環大量積聚在肺，其次分布在肝中，保留時間較長，同時觀察到炎癥細胞浸潤，肉芽腫和肺水腫的形成[14]。遺傳毒性試驗主要用于致癌性預測，而目前在體外細胞水平上的GO遺傳毒性研究少有報道。如Chng和Pumera[16]研究發現，GO能誘導人肺成纖維HLF細胞的氧化應激反應，細胞毒性呈現濃度依賴性，尾長和尾DNA百分比的增加揭示出GO具有遺傳毒性。Stueckle等[17]的彗星試驗結果表明，nano-GO誘導肺部細胞(A549)的DNA損傷有很大作用。Mohamed等[18]發現，GO可以引起DNA的遷移，引起DNA損傷，導致DNA片段化。Bengtson等[19]將單次氣管內暴露于GO和還原氧化石墨烯(rGO)后，發現GO和rGO分別在不同時間點可誘導肺、肝DNA損傷。此外，非片層結構的石墨烯同樣被發現有一定的遺傳毒性，如Kim等[20]采用Ames試驗、體外染色體畸變試驗和小鼠骨髓微核試驗對單臂碳納米管(SWCNT)的遺傳毒性進行檢測。結果顯示，Ames試驗未發現細菌回變現象，微核試驗結果為陰性，體外染色體畸變試驗為陽性且額外觀察到了細胞增殖抑制現象，故認為SWCNT的遺傳毒性為弱陽性?？梢奊O及在其基礎上進一步衍生化的石墨烯類材料的遺傳毒性不容忽視。

圖3 GO致小鼠骨髓細胞染色體畸變圖注：(a). 小鼠骨髓細胞正常染色體；(b). 1.000 mg·kg-1 GO組染色體斷裂；(c). 0.500 mg·kg-1 GO組染色體缺失；(d). 環磷酰胺組染色體粉碎、交換、多倍體染色體；Giemsa染色，×100。Fig. 3 Chromosome aberrations of mouse bone marrow cells induced by GONote: (a). mouse bone marrow cells normal chromosome; (b). 1.000 mg·kg-1 GO group chromosome break; (c). 0.500 mg·kg-1 GO group chromosome deletion; (d). cyclophoshamide group chromosome smashing, chromosome exchange and ploidy chromosome; Giemsa staining, ×100.

Ames從基因水平上反映了遺傳物質受損傷情況；染色體畸變的產生與染色體斷裂及紡錘體受損有關。依據《納米毒理學與安全性研究方法》[11]，針對遺傳物質作用終點的不同，并兼顧體外和體內試驗的配套原則，筆者采用Ames試驗、CHL細胞染色體畸變試驗和小鼠骨髓細胞染色體試驗，綜合分析這3種試驗的結果，以研究GO的致突變作用。本研究結果顯示，不管是否加入活化系統(S9)，GO各劑量組對TA-97a、TA-98、TA-100和TA-102這4種菌株回復突變菌落數的影響均在正常范圍內，與陰性對照組相比無顯著性差異，提示GO在體外Ames試驗中無致突變作用。但是在細胞水平和體內水平的染色體畸變試驗中，隨著GO濃度的增加，染色體畸變率顯著升高，有明顯的劑量-反應關系，提示GO在體內外的染色體畸變試驗中具有潛在的遺傳毒性。已有研究發現，與嚙齒類動物腫瘤相關度最高的傳統Ames試驗無法有效檢出納米粒子的潛在致突變性，而體外微核試驗、染色體畸變試驗及彗星試驗卻通?？梢缘玫疥栃越Y果[21]。這與本研究結果一致，即GO的Ames致突變性試驗結果呈陰性，但染色體畸變試驗結果卻呈陽性。進一步分析導致Ames試驗無法準確評價納米粒子的致突變作用的原因可能在于：(1)傳統的Ames試驗使用固態培養基，培養基為堿性環境，固態且帶大量負電荷的培養條件限制細菌與納米粒子充分接觸；(2)菌壁與哺乳動物細胞壁有差異，加之革蘭氏陰性菌的菌壁較厚，可導致納米材料不易穿透胞壁，與細菌接觸不充分，限制納米粒子被細胞攝取；(3)另外，有些納米材料具有一定的滅菌作用[22]。

目前沒有任何單一的試驗方法可同時涵蓋所有遺傳終點。為全面考察GO的潛在遺傳毒性風險，通常需開展一系列機制上互相補充的試驗，對GO的遺傳毒性及其作用機制，可進一步研究和探討。