1株耐多種重金屬菌株的分離鑒定

劉士堯，劉珮熠，徐羽豐，龍云飄，牛曉磊，李春霞，陳銀華，陶 均

(海南大學 熱帶農林學院/海南省熱帶生物資源可持續利用重點實驗室，海口 570228)

海南昌江石碌鐵礦是大型的露天鐵礦床[1]，形成于大型火山沉積、變質等過程，富含多種重金屬[2-3]。昌江縣屬于典型的熱帶季風氣候區，終年高溫，旱雨季明顯，植被繁茂，然而石碌鐵礦尾礦場卻地表裸露，植被稀少，這反映出其土壤中重金屬環境復雜。這樣特殊的地質環境與氣候特性相結合給極端微生物制造了得天獨厚的生長環境，也會孕育出一批具有特殊功能的微生物群落。重金屬污染是中國乃至世界各國快速發展中都會遇到的環境問題[4-5]。重金屬污染多為多種重金屬復合型污染，而非單一化學元素污染，其污染主要來自采礦、冶煉、化工等行業不合理排放，以及農藥化肥的不合理使用。Friesl W等研究表明，在工業礦區和污灌區的重金屬污染主要以Cu，Cd，Pb等元素為主，在廢舊電池處理工廠，Pb，Cu，Zn 等重金屬元素也嚴重超標[6-7]。土壤中的多種元素以及其他化合物復合污染形勢已經日趨嚴峻，其間復雜的相互作用也增加了環境修復的難度。目前，土壤重金屬修復主要通過物理方法、化學方法和生物方法，但上述方法僅針對單一元素的土壤污染修復進行研究，而針對多種元素復合型污染的相關研究較少[8]。研究重金屬復合污染的土壤修復技術是未來的發展趨勢和方向。筆者在海南石碌礦區的土壤樣品中發現了1株對多種重金屬具有耐受力的菌株，并對其進行分離鑒定，旨在為土壤重金屬污染修復提供參考。

1 材料與方法

1.1土壤本實驗所用土壤采集于海南昌江石碌礦區(北緯19°14′東經109°4′)表層5～10 cm的土壤，采取5份樣品，土壤樣品裝于無菌土壤樣品瓶中，取部分土壤進行實驗，其余樣品貯存在4 ℃的冰箱中備份待用。根據文獻記載，此處土壤中Cu，As，Fe超過同類土壤環境質量標準[9]。

1.2試劑本實驗PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司，測序服務來自華大基因(廣州)公司，其他化學試劑購自廣州化學試劑公司和Sigma-Aldrich。

1.3培養基Luria-Bertani (LB) 培養基： 10 g胰蛋白胨，10 g氯化鈉 ，5 g 酵母提取物，蒸餾水定容至1 L，pH7.0～7.2。篩選培養基：LB培養基+各種不同濃度的金屬離子。

1.4菌株的篩選與分離取土樣5 g裝入含有45 mL無菌水的離心管中，充分混勻后1 867 r·min-1離心2 min，取上清并稀釋制成10-2，10-3，10-4懸液備用。

配制不同銅離子(Cu2+)質量濃度(10，50，100，250，500，1 400 mg·L-1)的LB固體培養基，并用高壓蒸汽鍋滅菌。取質量分數為10-2，10-3，10-4的土壤懸液各100 μL涂布在含銅離子濃度不同的培養基上，每種濃度3個重復，28 ℃培養箱培養1～5 d。觀察培養基上細菌的生長狀況，篩選出菌株的最大耐受范圍。

挑取在最高質量濃度Cu2+培養基上生長的單菌落，再按平板劃線法進行培養，觀察長出菌落是否單一且一致，如果不滿足條件，則繼續平板劃線法培養直至菌落形態單一、一致。

將篩選到的菌株置于含Cu2+質量濃度分別為100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000，1 200 mg·L-1的液體培養基中進行再次篩選，檢測得到菌株在液體環境中的最大耐受程度及最適合的生長環境。

1.5菌株的鑒定

1.5.1 形態學鑒定將通過篩選獲得的菌株劃線于LB固體培養基上得到單菌落，觀察菌落大小、顏色、形狀、凸起、透明度等，并進行革蘭氏染色，觀察染色的陰陽性和菌體形態。根據以上表型對比分析菌株類型。

1.5.2 分子生物學鑒定利用細菌16S rRNA基因進行鑒定，利用其通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增測序。將檢測無誤的純化片段送華大基因(廣州)公司進行測序，通過NCBI中的BLAST方法進行分析，并與NCBI里9株其他細菌的16S rDNA序列進行比對，應用MEGA6.06軟件利用最大似然法構建系統發育樹。

1.6菌株的最適生長條件的測定

1.6.1 菌株的最適pH將菌株以體積分數為1%的量分別接種于不同pH值(pH為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)的液體培養基(5 mL)中，3次重復，180 r·min-1，28 ℃條件下振蕩培養，24 h后測定光密度值OD600。

1.6.2 菌株的最適溫度將菌株以體積分數為1%的量分別接種于多個10 mL培養基中，分別放置于24，26，28，30，32，34，36 ℃進行培養，每個溫度3個重復，180 r·min-1，pH6.0條件下進行振蕩培養，24 h后測定光密度值OD600。

1.6.3 菌株的最適滲透壓將菌株以體積分數為1%的量分別接種于NaCl不同終質量分數(0，0.5%，1%，1.5%，2%，3%)的液體培養基進行培養，每個終質量分數為3個重復，180 r·min-1，34 ℃，pH6.0條件下進行振蕩培養，24 h后測定光密度值OD600。

1.7菌株對Pb2+和Cd2+耐受性的影響配制含Pb2+質量濃度分別為100， 300， 500， 700， 900， 1 100，1 300，1 500，1 700 mg·L-1；Cd2+質量濃度分別為50，100，150，200，250，300 mg·L-1的液體培養基，接種并培養菌株，24 h后測定OD600值。得到濃度后將3種金屬以組合的方式加入到液體培養基中(①Cu，Pb；②Cu，Cd；③Pb，Cd；④ Cu，Pb，Cd)，接種并培養菌株，24 h后測定OD600值。

2 結果與分析

2.1耐Cu2+菌株的篩選土壤懸浮液經過1 400 mg·L-1Cu2+平板培養分析后，挑取6個差別明顯、個體較大的單菌落(菌株命名為：Cu-1，Cu-2，Cu-3，Cu-4，Cu-5，Cu-6)進行金屬濃度梯度培養，每個梯度3個重復，篩選耐Cu2+能力最強的菌株。

表1 6株菌株在不同銅離子濃度下的生長情況

注：生長良好：+++ 生長一般：+ 不生長：—

Notes: Normal growth: +++; weak growth: + ; none:—

從表1可知，有4株菌株能在含800 mg·L-1Cu2+的液體培養基中生長。由于Cu-6菌株穩定性最好，故本次研究主要討論菌株Cu-6。

本實驗篩選出的菌株是從礦區土壤中直接分離得到的，菌株并未經過高濃度重金屬離子的馴化，表明菌株是天然耐Cu2+菌株，長期在Cu2+含量高的土壤中生存，對Cu2+毒性有較高耐受能力。經傳代實驗(5次轉接)驗證其Cu2+耐受性具有遺傳穩定性，這種特性利于將其應用于實際土壤修復中。

2.2菌株鑒定從圖1可見，Cu-6菌落呈淡黃色，表面光滑，圓形，不透明，邊緣整齊。從圖2可見，革蘭氏染色呈陰性，為短粗桿菌。

圖1 菌株Cu-6在LB培養基上劃線的生長 圖2 革蘭氏染色結果

16S rDNA為原核生物所共有，其功能同源且最古老，既含有保守序列又含有可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進化距離相對應。為得到可靠的種屬鑒定結果，對該菌株進行16S rDNA序列鑒定，以菌株Cu-6 的DNA為模板，通過PCR擴增得到長度約為1 500 bp的片段(圖3)。

測序得到Cu-6菌株的16S rDNA長度1 441 bp。通常，如果2個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%, 則認為屬于同1個分類單位。將菌株Cu-6的16S rDNA基因部分序列與其他細菌的相應序列進行比對(表2)，同時運用MEGA構建Cu-6菌株的系統發育樹(圖4)。結果顯示，菌株Cu-6屬于陰溝腸桿菌屬，通過BLAST和伯杰鑒定法確定待測菌株Cu-6屬于陰溝腸桿菌屬(Enterobactercloacae)

表2 16S rDNA blast結果

2.3菌株的最適生長條件

2.3.1 菌株最適pH從圖5-A可知，菌株Cu-6在pH6.0時生長狀態好，表明pH6.0為其生長最佳pH。重金屬離子在酸性條件下可溶，當溶液偏向中性及堿性時會形成沉淀,不利于對污染土壤的治理。海南土壤環境是偏酸性的，菌株生長的最佳pH值也是酸性的，與其生長環境一致，有可能用于修復海南重金屬污染的土壤。

圖4 Cu-6菌株系統發育樹

2.3.2 菌株最適溫度從圖5-B可知，菌株Cu-6在34 ℃生長較好，更高溫度(36 ℃)也能生長，說明其具有一定的耐熱性。

2.3.3 菌株最適滲透壓從圖5-C可知，菌株在NaCl終質量分數小于1.5%的培養基中生長狀態良好，當 NaCl 質量分數增加到 2%，3%時，細菌仍能生長，說明該菌株具有較強的鹽耐受能力，能在離子強度較高的環境中生存，具有很好的滲透壓調節能力。

2.4Pb,Cd及其與Cu混合溶液對菌株生長的影響從圖6-A可知，菌株在含300 mg·L-1Pb2+的培養基中生長最好，進一步提高Pb2+質量濃度時，對菌株生長沒有較大影響，即使在含1 700 mg·L-1Pb2+的培養基中也能生長，表明篩選出的菌株具有較強鉛耐受性。

菌株在含Cd2+50 mg·L-1的培養基中生長良好(圖6-B)，說明篩選出的菌株具有較強鎘耐性，進一步提高Cd2+質量濃度至150 mg·L-1時，細菌仍然能夠生長，再提高Cd2+質量濃度將顯著抑制菌株生長。

由圖6-C可知，菌株在400 mg·L-1Cu2++ 300 mg·L-1Pb2++150 mg·L-1Cd2+的混合溶液中振蕩培養24 h后仍能生長良好，顯示出菌株在復雜金屬脅迫環境中仍然有很強的生存能力，有利于細菌在復雜重金屬污染土壤中生存。

3 討 論

近年來，利用生物技術進行重金屬污染修復的研究取得了長足進展，尤其以微生物吸附和植物富集為主[10-11]。而微生物吸附主要依賴于菌株吸附重金屬的能力與耐受多種重金屬環境的能力，其中，菌株的環境適應能力是其發揮作用的基礎條件。例如，康薇等篩選出菌株TLSB2-K (Bacillussp. )的最佳pH是7，最適生長溫度為27 ℃，最佳滲透壓(NaCl)為1.1%，最高耐Cu2+質量濃度為700 mg·L-1 [12]；王海鷗等篩選出1株耐銅菌株 USTB-E (pseudomonassp.)，最適生長溫度為 35 ℃，pH6.0，滲透壓(NaCl)為0. 3%，最高Cu2+耐受質量濃度為 560 mg·L-1[13]；李倩等馴化得到耐Cd2+菌株H6 (Bacilluscereus)，最大Cd2+耐受質量濃度為 350 mg·L-1[14]；這些研究都是針對某一種特定的重金屬，但對復雜重金屬污染土壤的實際作用有限。

本實驗采用常規純培養方法從礦區土壤中分離篩選耐重金屬微生物，并獲得1株耐銅、鉛、鎘能力強的陰溝腸桿菌菌株Cu-6。吳海江等篩選和分離獲得了1株耐受200 mg·L-1Cd2+的陰溝腸桿菌[15]，其耐Cd2+水平略高于菌株Cu-6的150 mg·L-1，但其菌株的復合耐受水平較弱。SETHURAMAN P. 等也發現了對鉛、鎘的耐受能力分別為300，200 mg·L-1的陰溝腸桿菌，但對鉛鎘的復合抗性較小[16]。筆者篩選的Cu-6菌株分別能在含800 mg·L-1Cu2+，1 700 mg·L-1Pb2+，150mg·L-1Cd2+的培養基中生長，表明此未經馴化菌株對銅、鉛、鎘的耐受能力明顯優于已發現的菌株。

國內外學者的大量研究表明，微生物對重金屬的耐受機理比較復雜，主要用通過其菌體表面吸附與絡合效應、靜電結合、離子交換型吸附、氧化還原、胞外沉淀、胞內累積效應等方式實現[17-18]。陰溝腸桿菌的耐受機理，可能是依靠胞外沉淀方式來實現[15]，菌株Cu-6的耐受機理可能與之相似，但其具體耐受機理還需要進行更深入的研究。菌株Cu-6良好的復合重金屬耐受性與良好的環境適應能力暗示其可能具有對海南土壤重金屬污染修復的潛力。

DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20170632)[2018-10-08].http:∥www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-WSXB20180404001.htm.