反相高效液相色譜法對小鼠血清中基因重組人促腎上腺皮質(zhì)激素前體及其代謝物的測定

武新麗，韋雙雙，裴業(yè)春,3，趙景鋒，王大勇

(1.海南大學 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室，海口 570228； 2.海南大學 熱帶農(nóng)林學院生物學院 生物技術與分子藥理實驗室，海口 570228； 3.海南大學 熱帶農(nóng)林學院 動物科技學院，海口 570228 )

促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone，ACTH)又稱為促皮質(zhì)素(Corticotropin)，是由 39 個氨基酸構成的多肽激素，主要由垂體前葉分泌，也發(fā)現(xiàn)于下丘腦、腎上腺髓質(zhì)等組織[3-4]。ACTH能夠調(diào)控糖皮質(zhì)激素(GC)的合成與分泌，影響糖、脂肪和蛋白質(zhì)的合成與代謝，調(diào)節(jié)心腦血管功能，提高機體抵抗力，促進神經(jīng)損傷恢復與再生，還具有抗炎、免疫抑制、抗毒素、抗休克等作用。ACTH是治療兩歲以下嬰兒驚厥癥的唯一特效藥，該病發(fā)病率為0.5%～1%，6%～33%的嬰兒驚厥癥患兒在3歲前死亡，70%～90%患兒智力發(fā)育緩慢，30%發(fā)展為自閉癥。除此之外，ACTH也用于紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化病急性惡化、腎病綜合征、全身性皮肌炎和結(jié)節(jié)病的治療，以及銀屑病關節(jié)炎、風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎以及嚴重眼部過敏和炎癥等的輔助治療[5]。ACTH的半衰期很短，約為10 min，需要反復大量用藥[6]。目前，國內(nèi)臨床應用的ACTH由家豬的腦垂體中提取，容易傳播動物病毒和支原體。人工合成的ACTH(1-24)的體內(nèi)半衰期更短，并且工業(yè)化生產(chǎn)成本高，未見藥用。ACTH(1-39)的前體蛋白是鴉片樣肽促黑激素促皮質(zhì)激素原(Propiomelanocortin，POMC)，天然存在酶切底物序列(POMCst)，在體內(nèi)逐步被絲氨酸內(nèi)切酶——激素原轉(zhuǎn)化酶1(Prohormone convertase 1，PC1)，PC2和PC3水解，釋放出ACTH(1-39)[7-9]。此外，POMC經(jīng)蛋白酶酶切還可以產(chǎn)生其他多種代謝產(chǎn)物，包括γ-促脂素、γ3-促黑素和γ1-促黑素等[10-11]。在前期實驗中，本試驗室構建了多種基因重組人促腎上腺皮質(zhì)激素前體蛋白，其中一種由141個氨基酸構成的ACTH前體蛋白(ProACTH141)在血液中比ACTH更加穩(wěn)定，并且具有良好的藥理作用。在ProACTH141的結(jié)構中ACTH的N末端增添了一段多肽鏈，可以防止具有藥理活性的N末端被氨肽酶快速降解，從而降低微生物表達過程中的降解速度；延長藥物的體內(nèi)半衰期，減少給藥次數(shù)和劑量。基因工程制藥法還可以避免傳播動物病毒的潛在風險。研究目的是探討采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時測定在一定的時間內(nèi)小鼠血清中重組人促腎上腺皮質(zhì)(ACTH)激素前體蛋白(ProACTH141)及其代謝產(chǎn)物ACTH(1-39)的實驗方法，用于分析ACTH前體蛋白質(zhì)的藥物代謝動力學特性。

1 材料與方法

1.1儀器與材料LC-20AD高效液相色譜儀 (日本島津)、ME204E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)、PS-40超聲波清洗儀(深圳超藝達科技有限公司)。ACTH(1-24)(批號：human-20180810，純度≥95.0%，生工生物工程有限公司)，ACTH(1-39)(批號：P14976-20171124，純度≥95.0%，生工生物工程有限公司)，乙腈和三氟乙酸(色譜純，北京邁瑞達科技有限公司)。SPF級昆明種雄性小鼠(5周齡)(海南省實驗動物中心)。

1.2載體構建針對BL21-DE3基因工程菌密碼子偏好性，優(yōu)化HisTag-EKst-ProACTH141 cDNA核苷酸序列，并在5' 端添加NdeI酶切位點，在3' 端添加SalI酶切位點，人工合成cDNA。合成的cDNA經(jīng)NdeI和 SalI雙酶切。回收cDNA酶切片段連接至同樣雙酶切的pET21a載體，以構建pET21a- HisTag-EKst-ProACTH141原核表達質(zhì)粒。

1.3HisTag-EKst-ProACTH14蛋白原核表達將構建好的原核表達質(zhì)粒pET21a-HisTag-EKst-ProACTH141轉(zhuǎn)化入BL21-DE3工程菌感受態(tài)細胞，復蘇2 h后接種到含有陽性篩選抗生素的LB半固體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)16 h后挑取單克隆菌落至50 mL 含有氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)，37 °C，180 r·min-1振蕩過夜。按1∶50接種到250 mL的含有氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)，OD600= 0.6～0.8。移取1 mL菌液作為非誘導對照，剩余菌液加入IPTG(終濃度0.1 mmol·L-1)，37 °C誘導表達 5 h 后采樣，SDS-PAGE電泳并考馬斯亮藍染色檢測表達量。

1.4HisTag-EKst-ProACTH141蛋白的純化誘導表達后的菌液經(jīng)6 000 r·min-1離心15 min收集菌體，每克濕重加入8 mL非變性裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl， 300 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)緩慢洗滌菌體。6 000 r·min-1，4 °C 離心10 min收集沉淀，反復洗滌3次。將菌液置于冰上，用超聲破碎儀破碎菌體，破碎功率為 400 W，破碎3 s，暫停5 s，反復破碎至菌液澄清。6 000 r·min-1，4 °C離心 20 min，收集合并上清液，用鎳柱純化HisTag-EKst-ProACTH141蛋白質(zhì)。

1.5腸激酶酶切及ProACTH141蛋白的純化測定純化后的HisTag-EKst-ProACTH141蛋白濃度，1 U腸激酶(EK)催化水解50 μg融合蛋白，1 μL≈3.3 U。帶His標簽的腸激酶溶解于酶切緩沖液(25 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.6，50 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1CaCl2)，25 °C溫育16 h，切割約95%樣品中的 HisTag-EKst-ProACTH141多肽鏈，得到游離的ProACTH141以及HisTag-EKst片段。用平衡緩沖液(50 mmol·L-1NaH2PO4，300 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)平衡 Ni柱，將EK酶切后的樣品液緩慢加至Ni柱中，流出液即為純化的ProACTH141目的蛋白質(zhì)。

1.6小鼠處理5周齡昆明種雄性小白鼠隨機分為2組，分別為對照組和ProACTH1411實驗組，每組12只。實驗組尾靜脈注射ProACTH141，劑量為56 pmol·g-1，對照組注射等體積生理鹽水。注射1，5，10，15，20，30，45，60，80和100 min后摘眼球采血，4 °C，4 000 r·min-1離心10 min，收集血清[12]。

1.7標準品溶液的制備分別稱取適量純度超過95%的ACTH (1-24)，ACTH(1-39)和ProACTH141凍干粉，溶解于0.1% TFA溶液，通過預實驗確定每種多肽或蛋白質(zhì)標準品的保留時間。以濃度為0.3 mg·mL-1ACTH(1-24)作為定量標準品。

1.8樣品預處理取2 μL ACTH(1-24)儲備液加入298 μL血清中，加入600 μL乙腈充分振蕩10 min，5 000 r·min-1離心10 min棄去上清。緩慢吹入氮氣揮去乙腈，加入298 μL 0.1% TFA，振蕩使其充分溶解，再次離心后取上清，以0.45 μm針頭式濾器過濾[13-14]。

1.9色譜條件色譜柱：Inertsil?C18柱(4.6×150 mm，? 5 μm) ，流速：1.0 mL·min-1，進樣體積： 20 μL，柱溫：室溫，檢測波長：280 nm，流動相：0.1% 的TFA(A)-含0.1% TFA的乙腈(B)梯度洗脫液[15]，梯度程序見表1。

表1 HPLC 梯度洗脫程序

3 結(jié)果與分析

3.1載體構建重組質(zhì)粒NdeⅠ和 SalⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小和預測大小(477 bp)相符(圖1A)。

3.2ACTH141蛋白誘導表達及鎳柱親和層析純化誘導物IPTG終濃度為0.1mmol·L-1，大腸桿菌在37 °C誘導表達5 h后，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明上清液中存在較大量HisTag-EKst-ProACTH141蛋白(表觀相對分子質(zhì)量約25×103)，并且純化效果良好(圖1B)。

圖1 重組質(zhì)粒pET21a-HisTag-EKst-ProACTH141雙酶切鑒定及蛋白的原核表達及純化結(jié)果

3.3腸激酶酶切及ProACTH141蛋白的純化HisTag-EKst-ProACTH141蛋白經(jīng)帶有組蛋白標簽的EK酶切得到proACTH141。HisTag-EKst-ProACTH141及ProACTH141經(jīng)SDS-PAGE(15% Tris-Glycine聚丙烯酰胺凝膠)分離，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜后用抗體檢測，一抗為鼠抗人ACTH(Abcam)抗體，二抗為Alexa488標記的羊抗鼠抗體(Abcam)，用Typhoon FLA 9500(GE Healhcare)檢測熒光條帶，見圖2泳道1，2所示。

3.4ProACTH141，ACTH(1-39)及ACTH(1-24)的RP-HPLC色譜圖ProACTH141，ACTH(1-39)及ACTH(1-24)凍干粉溶解于0.1%TFA中，用配備了C18反相色譜柱的島津高效液相色譜儀檢測3種蛋白質(zhì)或多肽的系統(tǒng)保留時間。經(jīng)測定，ACTH(1-24)的保留時間為(13.23±0.02) min，ACTH(1-39)的保留時間為(15.24±0.05) min，ProACTH141的保留時間為(26.12±0.05 min)(圖3)。

3.5不同時間血清中ProACTH141及ACTH(1-39)的含量尾靜脈注射ProACTH141蛋白，注射后1，5，10，15，20，30，45，60，80和100 min快速摘眼球采血。通過HPLC反相色譜法測定ProACTH141蛋白及其代謝物ACTH(1-39)在小鼠血清中的含量，ProACTH141蛋白含量1 min 時的濃度為19.01 mg·L-1，然后逐漸降低，在100 min時恢復到血清基線水平，其半衰期(T1/2)為21.9 min。ACTH(1-39)的血清達峰時間(Tmax)約為20 min，其后逐漸降低。從1～100 min，ProACTH141和ACTH(1-39)的藥時曲線下面積(AUC)分別為538.2和88.2 (mg·L-1)·min-1。

3 討 論

ACTH是治療小兒痙攣癥的唯一特效藥，目前國內(nèi)僅有一家生化藥廠從動物腦垂體中提取生產(chǎn)，成本較高，供不應求[16]。美國同類藥品Acthar單劑(5 mL)價格超過4萬美元(CVS Pharmacy/Walgreens，2018.11)。人體內(nèi)天然存在識別POMC酶切底物序列(POMCst)的蛋白酶，包括PC1,PC2和PC3。其酶切過程分為3個部分。(1)PC1和PC3可酶切得到β-促脂素和ACTH前體2段多肽鏈。(2)PC1,PC2和PC3共同發(fā)揮作用，PC1，PC3識別ACTH前體中的酶切位點，PC2識別β-促脂素中的酶切位點。(3)PC2發(fā)揮酶切作用釋放出具有生物活性的短肽[18]。POMC在3種蛋白酶作用下，逐漸水解釋放出游離的ACTH(1-39)。針對這一酶切特性，筆者設計表達了多種ACTH前體藥物，一方面考察不同長度的ACTH前體是否具有與ACTH相同的藥理作用，另一方面考察它們的藥物代謝動力學特性，包括T1/2，Tmax和AUC。前期預實驗中發(fā)現(xiàn)包含141個氨基酸的ACTH前體蛋白ProACTH141不但具備良好的藥效，并且在血液中的半衰期較長，發(fā)揮藥效的時間長于ACTH(1-39)。本研究采用RP-HPLC法測定ProACTH141蛋白其T1/2，其結(jié)果與預實驗的一致，并長于ACTH(1-39)。

針對待分離的蛋白質(zhì)，筆者對分析條件作了優(yōu)化。首先，選擇從血液中提取ProACTH141及ACTH(1-39)的溶劑。采用液液萃取法，比較了甲醇、乙腈等多種溶劑對注射到血液中的ProACTH141及ACTH(1-39)的提取效果。其中，乙腈對兩者的提取回收率均較高，且色譜峰形對稱，故以乙腈作為提取溶劑。其次，選擇檢測波長。取標準品混合液注入RP-HPLC，應用PDA檢測器，在210 nm及280 nm波長掃描[19]，結(jié)果顯示3個成分在210 nm和280 nm均有較好的紫外吸收，其中280 nm紫外吸收高于210 nm，且基線和峰形較好，干擾少，色譜圖較理想，因此選擇280 nm作為檢測波長。第三，流動相的選擇。由于血清成分復雜，用組分恒定的流動相難以將ProACTH141與ACTH(1-39)很好地分離而且保留時間較長，因此，本試驗采用兩種流動相(A與B)混合梯度洗脫。通過比較多種流動相系統(tǒng)，確立以0.1%(V/V)TFA緩沖液(A)與含0.1%(V/V)TFA緩沖液的乙腈溶液(B)混合梯度洗脫，色譜分離度較高，基線平穩(wěn)。