姜黃素對非通氣側肺損傷模型大鼠單肺通氣的改善作用研究

王小娟，王信磊

（1.中國人民解放軍第九四醫院，江西 南昌 330002； 2.南昌大學第一附屬醫院，江西 南昌 330002）

單肺通氣是胸部手術后急性肺損傷的主要原因。研究表明，機械通氣、肺毛細血管張力衰竭、氧化應激或缺血再灌注損傷均可引起單肺通氣肺損傷[1-3]。磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）-蛋白激酶 B（PKB，Akt）-低氧誘導因子-1α（HIF-1α）信號傳導通路能調控肺泡存活、阻止肺泡細胞凋亡、促進損傷肺泡細胞再生[4]。PI3Ks不僅是Akt的激活物，還可能是Akt在胞漿中的錨定器，當信號通路無活性時，它就將Akt固定在胞漿中，一旦有信號刺激Akt磷酸化及二聚體化，它就激活Akt，并將其轉移到胞核或其他活化位點，再進一步磷酸化下游底物，進而導致Akt受體通道開放時間延長，HIF-1α活性增強，誘導一系列氧化損傷及免疫反應[5-6]。姜黃素是從一些姜科、天南星科植物的根莖中提取的化學成分，有調血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用[7]。本研究中擬基于PI3K-Akt-HIF-1α信號通路探討姜黃素對非通氣側肺損傷模型大鼠單肺通氣的改善作用，為相關疾病的干預治療提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

動物：清潔級SD大鼠100只，雌雄兼半，12周齡，體質量（108.65±12.09）g，由山東大學醫學院動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（魯）20001003。動物自由攝取飼料及飲水，自動控制晝夜循環（12/12 h），室溫（22±1）℃。每周稱體質量1次，每周調換籠位1次，符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

試藥：姜黃素（自行提取，每1 g提取物濃縮液相當于生藥 10.39 g）；PI3K，Akt，HIF-1α 及血管內皮生長因子（VEGF）、白細胞介素 6（IL-6）、腫瘤壞死因子 -α（TNF- α）、酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號分別為 KIT130974-6，KIT132087-3，KIT109759-4，KIT130854-4，KIT132058-7，KIT109793-4）均購自上海廣銳生物科技有限公司；PI3K，Akt，HIF-1α逆轉錄試劑盒及實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司；BisulFlashTMDNA甲基化修飾試劑盒（寶生物工程<大連>有限公司）。

儀器：實時熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；CX21型光子顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 分組、給藥與建模

將100只SD大鼠隨機分為5組，即正常對照（等體積0.9%氯化鈉溶液）組、模型（等體積0.9%氯化鈉溶液）組和姜黃素高、中、低劑量（20，10，5mg/kg）組，各20只。根據成人劑量公式換算，大鼠用藥量為成人的20.13倍，以10.0 mL/kg劑量灌胃，將藥液質量濃度制備成10.0 g/mL。模型組與姜黃素高、中、低劑量組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進行麻醉，開始劑量為50 mg/kg，然后減少至15 mg/kg（每間隔1 h給藥1次）。行氣管切開術后，用16號導管插管，并在室內空氣中以每分鐘100循環的呼吸速率維持2.5 mL潮氣量的機械通氣。在機械通氣期間施加1.5 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）的呼氣末正壓。在第五肋間進行右側胸廓切開術后，將氣管導管插入左主支氣管深處，并將潮氣量減少至2.0 mL。在一段特定的單肺通氣后，氣管導管從左主支氣管撤回到氣管，并使用10 mL注射器通過氣管導管將8 mL空氣注入雙肺，使右肺重新擴張。隨后，將潮氣量增加至2.5 mL，并進行雙肺通氣。術后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續3 d。建模成功后，各組大鼠灌胃相應藥物，每天1次，連續7 d。

1.3 觀察指標測定

濕肺質量/體質量的測定及肺損傷評分：灌胃給藥結束后，頸椎脫臼處死大鼠，取右肺組織，測定并計算濕肺質量/體質量；隨后取右側部分肺組織進行常規染色切片，鏡下閱片，就肺間質水腫、肺泡水腫、中性粒細胞浸潤和肺泡內充血4項進行評分，無改變或改變非常輕微為0分，輕度改變為1分，中度改變為2分，重度改變為3分，極重度改變為4分，累計4項的總分即為肺損傷評分。

PI3K，Akt，HIF-1α mRNA 表達水平測定：采用PCR法。以Trizol法提取總RNA。反轉錄制備cDNA。使用內源性U6小核RNA（U6）進行標準化（U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。通過 2-ΔΔCT法計算 PI3K、Akt、HIF-1α mRNA相對表達水平。PCR引物序列如下，PI3K 上游：5′-AGTCTATACAAGGGCAAGCTCTC-3′，下 游 ：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′；Akt上游：5′-ATTTCACCAATCTTGTCTCCATCA-3′，下游：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′；HIF-1α 上游：5′-ATTCTACCAATCTTGTATCTACG-3′，下 游 ：5′-ATTCTGCTGTTCGACAGATTCG-3′。反應體系，正向引物 10 μL、反向引物 10 μL、RNA 模版 0.6 μL、超級酶混合物 0.2 μL、2 × 反應緩沖液 5 μL、去 RNA 水 3.4 μL。PCR條件，95℃持續10 min，循環40次，持續15 s，溫度60℃。

PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平測定：采用ELISA法。稱取大鼠右側肺組織，制成勻漿，收集上清液，按試劑盒說明書測定。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 濕肺質量/體質量比值、肺損傷評分

結果見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠濕肺質量/體質量、肺損傷評分顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組大鼠濕肺質量/體質量、肺損傷評分均明顯降低（P<0.05），且隨著姜黃素給藥劑量的增加，濕肺質量/體質量、肺損傷評分逐漸降低，劑量-效應關系明顯。

表1 各組大鼠濕肺質量/體質量、肺損傷評分比較（±s，n=20）

表1 各組大鼠濕肺質量/體質量、肺損傷評分比較（±s，n=20）

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。下表同。

組別正常對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組劑量（mg/kg）5 10 20濕肺質量/體質量4.92±0.32 10.04±0.49#8.32±0.36*6.24±0.41*5.00±0.52*肺損傷評分（分）2.20±0.21 8.75±0.37#5.35±0.31*4.91±0.26*2.31±0.50*

2.2 右側肺組織HE染色

采用蘇木素-伊紅（HE）染色，結果見圖1。正常對照組大鼠未見明顯肺泡破壞，無中性粒細胞浸潤，無膠原蛋白沉淀；模型組大鼠肺泡嚴重破壞，肺泡壁明顯增厚，較多膠原蛋白沉淀于肺間質，中性粒細胞浸潤明顯；姜黃素低、中劑量組大鼠肺泡破壞程度較模型組輕，有較多中性粒細胞浸潤；姜黃素高劑量組大鼠肺泡結構基本正常，有少量中性粒細胞浸潤，幾乎無膠原蛋白沉淀。

圖1 各組大鼠右側肺組織染色比較（HE，×400）

2.3 肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表達水平

結果見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中PI3K及AktmRNA表達水平顯著降低，HIF-1αmRNA表達水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組大鼠肺組織中PI3K及Akt mRNA表達水平顯著升高，HIF-1α mRNA表達水平顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素給藥劑量的增加，PI3K及Akt mRNA表達水平逐漸升高，HIF-1α mRNA表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯。

表2 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表達水平比較（±s，n=20）

表2 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α mRNA表達水平比較（±s，n=20）

組別正常對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組劑量（mg/kg）5 10 20 PI3K 1.76±0.17 0.98±0.12#1.09±0.17*1.12±0.16*1.73±0.20*Akt 1.94±0.11 0.56±0.13#0.91±0.18*1.49±0.20*1.90±0.11*HIF-1α 1.13±0.21 2.18±0.19#1.87±0.18*1.52±0.09*1.16±0.19*

2.4 肺組織中 PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達水平

結果見表3。與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達水平顯著降低，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，姜黃素高、中、低劑量組大鼠肺組織中PI3K和Akt蛋白表達水平顯著升高，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05），且隨著姜黃素給藥劑量的增加，PI3K和Akt蛋白表達水平逐漸升高，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平逐漸降低，劑量-效應關系明顯。

表3 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平比較（±s，ng/g，n=20）

表3 各組大鼠肺組織中PI3K，Akt，HIF-1α，VEGF，IL-6，TNF-α 蛋白表達水平比較（±s，ng/g，n=20）

組別正常對照組模型組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組劑量（mg/kg）5 10 20 PI3K 183.67±15.63 71.14±16.78#103.73±13.65*123.17±99.69*181.58±13.74*Akt 145.77±6.46 67.86±6.98#89.45±6.98*120.15±10.69*139.63±12.73*HIF-1α 47.13±15.95 187.66±9.47#134.14±12.74*63.23±10.73*49.45±18.76*VEGF 78.98±16.32 326.21±19.69#201.36±15.32*136.32±18.32*81.32±24.36*IL-6 123.65±23.21 413.65±13.69#302.67±19.32*203.36±17.32*129.68±36.69*TNF-α 99.36±18.63 589.36±18.34#432.39±15.39*319.25±19.99*103.26±26.39*

3 討論

單肺通氣是胸外科手術中的常規操作，其優化了手術的進入區域，在手術過程中隔離保護肺部，加快了手術過程。但在單肺通氣期間，非通氣肺塌陷仍需灌注，導致毛細血管局部栓塞，引發氧化損傷，缺血或不通氣導致的氧缺乏進一步加重肺泡細胞缺氧損傷[8-9]。在單肺通氣引發的非通氣側肺損傷中，若使用抗自由基藥物，則其非通氣側肺損傷程度明顯降低[10-11]。本研究結果顯示，姜黃素能明顯降低模型大鼠單肺通氣引發非通氣側肺損傷程度。

肺組織缺血引發的缺氧與海馬區域中抑制性氨基酸類神經遞質、興奮性氨基酸類神經遞質比例失調密切相關，認知功能障礙發生過程中，神經元去極化，鈉離子等陽離子大量內流，導致海馬區域中興奮性氨基酸類神經遞質谷氨酸（Glu）大量釋放，同時 γ-氨基丁酸（GABA）比例升高，進一步導致鈣離子內流，形成細胞內鈣超載，鈣離子作為第二信使，激活PI3K/Akt信號途徑[12-14]。HIF-1α是PI3K/Akt的下游調控因子，為堿性螺旋PAS結構域蛋白的異二聚體，其水平在機體監測到缺氧后立即升高，當血液中氧含量恢復正常水平后，HIF-1α通過蛋白依賴性蛋白酶體途徑連續降解，因此常氧條件下HIF-1α維持在低水平[15-16]。本研究結果顯示，姜黃素可通過PI3K-Akt信號傳導通路抑制HIF-1α mRNA及蛋白表達水平。

低氧刺激導致HIF-1α mRNA及蛋白水平快速增加，這是氧化還原敏感穩定的結果。在HIF-1異二聚化為HIF-1α后，進入細胞核并在靶基因的缺氧反應元件（HRE）處與 DNA 結合，促進 VEGF，IL-6，TNF-α的表達，進而引發一系列氧化損傷及免疫反應[17-18]。本研究結果顯示，姜黃素能明顯降低單肺通氣引發非通氣側肺損傷程度，其機制與姜黃素降低VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達水平有關。

綜上所述，姜黃素能明顯改善非通氣側肺損傷模型大鼠單肺通氣情況，其機制與姜黃素通過PI3K-Akt信號傳導通路抑制HIF-1α mRNA及蛋白表達水平，進而抑制VEGF，IL-6，TNF-α蛋白表達有關。