小牛血清去蛋白對(duì)腦缺血-再灌注損傷模型大鼠血腦屏障的保護(hù)作用研究*

鄧 超，鄭永強(qiáng)，徐 悅

（湖北省十堰市人民醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北 十堰 442000）

腦卒中又稱(chēng)中風(fēng)、腦血管意外，為急性腦血管疾病，其中缺血性卒中占60%～70%。腦缺血觸發(fā)的病理改變會(huì)影響血腦屏障（BBB）的通透性[1]，導(dǎo)致腦水腫和局部炎癥。本研究中以小牛血清去蛋白用于腦缺血-再灌注損傷模型大鼠，并分析其對(duì)模型大鼠BBB的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器與試藥

動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量為（250±20）g，購(gòu)自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK<鄂>2017-0008，適應(yīng)性喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，人工黑暗和光照交替，在體質(zhì)量達(dá)到（270±20）g時(shí)納入實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中大鼠的處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

儀器：JEM-2000EX型透射電鏡（日本電子光學(xué)公司）；CM3050S型冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BX-51型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

試藥：小牛血清去蛋白腸溶膠囊（錦州奧鴻藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20090346，規(guī)格為每粒5 mg，批號(hào)為 2820170104）；兔抗帶狀閉合蛋白 -1（ZO-1，美國(guó)CST公司）；免疫組化試劑盒（美國(guó)Molecular Probes公司）；伊文斯藍(lán)（EB，美國(guó) Sigma-Aldrich 公司）。

1.2 方法

建模、分組與給藥：按隨機(jī)數(shù)字表法將100只SD大鼠分為假手術(shù)組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液）、模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液）及小牛血清去蛋白低劑量組（C1組，7.5 mg/kg，按肽量計(jì)，下同）和高劑量組（C2組，37.5 mg/kg），各 25 只。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 d。參考線栓法相關(guān)文獻(xiàn)[2]，阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈，于缺血2 h后再灌注24 h，以建立腦缺血再灌注損傷模型。觀察大鼠左側(cè)肢體肌力減弱，運(yùn)動(dòng)左偏，解剖未見(jiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血?jiǎng)t表明模型復(fù)制成功。A組除不阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈外，其余操作同上。

腦組織EB染色：再灌注24 h后，于處死大鼠前1 h靜脈輸入EB 0.9%氯化鈉注射液（0.2 mL/100 g）。腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg），心臟注入0.9%氯化鈉注射液，開(kāi)顱取腦，稱(chēng)定大鼠腦濕質(zhì)量，切碎塊，置試管中，加4 mL甲酰胺，恒溫避光環(huán)境水浴3 d，3 000 r/min離心10 min，取上清液，于620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算腦組織EB含量。

BBB超微結(jié)構(gòu)觀察：再灌注48 h內(nèi)，腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）以麻醉大鼠（40 mg/kg），其中 B 組大鼠固定再灌注 0.5，2，6，12，24 h 時(shí)麻醉。經(jīng)左心室輸注0.9%氯化鈉注射液60 mL，灌注鑭醛固定液50 mL，開(kāi)顱取腦。將腦組織從視交叉向后冠狀切片成約1 mm，分別在缺血同側(cè)和對(duì)側(cè)相應(yīng)部位的皮質(zhì)及底節(jié)區(qū)各取2小塊腦組織，以透射電鏡觀察再灌注0.5，2～6，12～24，48 h時(shí)大鼠BBB的超微結(jié)構(gòu)。

免疫組化：再灌注24 h后，建模成功后腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）以麻醉大鼠，多聚甲醛心臟灌流，取腦組織，10%甲醛溶液固定24 h，并經(jīng)石蠟包埋，脫水、切片、染色。按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大體、光鏡、電鏡觀察結(jié)果

大體標(biāo)本可見(jiàn)，模型大鼠缺血側(cè)腦組織呈藍(lán)染，而對(duì)側(cè)未見(jiàn)藍(lán)染（見(jiàn)圖1），顯示大鼠腦間質(zhì)及神經(jīng)纖維腫脹，缺血處細(xì)胞變少，并同正常組織形成了移行帶。電鏡可見(jiàn)，B組大鼠腦組織內(nèi)皮細(xì)胞皺縮，管腔變形，基底膜斷裂；而C2組在光鏡下缺血部位有輕度間質(zhì)水腫，但不及B組的腫脹程度；腫脹程度較輕，基底膜尚未斷裂，較完整；C1組介于B組和C2組之間（見(jiàn)圖2）。

圖1 模型組大鼠腦組織染色大體圖

圖2 右半側(cè)大腦皮質(zhì)額葉冠狀切片電鏡觀察圖（HE，×400）

2.2 BBB超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

由圖3可見(jiàn)，A組大鼠腦組織非缺血區(qū)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接（TJ）正常，未見(jiàn)鑭顆粒。再灌注0.5 h，大鼠腦組織缺血區(qū)開(kāi)始腫脹，星型膠質(zhì)細(xì)胞足突有輕度腫脹，但與毛細(xì)血管基底膜連接仍較緊密；內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，其胞質(zhì)內(nèi)線粒體增多，TJ處可見(jiàn)鑭顆粒。再灌注2～6 h后，大鼠缺血區(qū)腦組織腫脹，膠質(zhì)足突及血管基底膜分離，間隙增加；內(nèi)皮細(xì)胞腫脹更明顯，可見(jiàn)空泡，胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)到鑭顆粒；神經(jīng)纖維微管排列不整齊，細(xì)胞間隙中有鑭顆粒。再灌注12～24 h時(shí)，大鼠腦組織缺血區(qū)嚴(yán)重腫脹，結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞變性壞死，核溶解，細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)到鑭顆粒；基底膜不連續(xù)；鑭顆粒經(jīng)血管漏出至腦實(shí)質(zhì)。再灌注48 h時(shí)，大鼠腦組織缺血區(qū)基本已無(wú)正常結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)大量小膠質(zhì)細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)有脂滴、壞死組織等，形似泡沫細(xì)胞；內(nèi)皮細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)電子密度變大，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)髓樣體。

圖3 BBB超微結(jié)構(gòu)圖

2.3 EB含量和ZO-1陽(yáng)性血管檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1。與A組比較，B組大鼠腦組織EB含量顯著增加，ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)顯著減少（P<0.05）；與B組相比，C1組和C2組大鼠腦組織EB含量顯著減少，C2組ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)顯著增加（P<0.05）。

表1 各組大鼠腦組織EB含量和ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠腦組織EB含量和ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)比較（±s）

注：與A組比較，#P<0.05；與B組比較，*P<0.05。

組別A組B組C1組C2組EB 含量（μg/g）10.53±1.28 54.69±2.20#49.52±2.27*44.91±3.15*ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)（條）9±2 2±1#3±1 4±2*

3 討論

BBB是腦組織結(jié)構(gòu)的一部分，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，微血管內(nèi)皮細(xì)胞是BBB的基本組成部分，它們形成了保障局部環(huán)境穩(wěn)定的第一道防線[3]。缺血再灌注后，缺血半暗帶組織可繼續(xù)存活[4]；但再灌注會(huì)導(dǎo)致代謝失衡[5]，使乳酸、炎性因子及自由基等生成過(guò)多[6]，令細(xì)胞骨架變化，細(xì)胞間連接數(shù)量變少[7]，BBB通透性升高[8]。ZO-1是TJ的重要成分[9]，可參與TJ跨膜蛋白的聯(lián)系[10]，其對(duì)生化反應(yīng)敏感[11]，腦缺血時(shí)，能及時(shí)應(yīng)答炎性細(xì)胞因子[12]，導(dǎo)致相關(guān)復(fù)合體解離，最終影響B(tài)BB[13]。

本研究結(jié)果顯示，大鼠缺血區(qū)腦組織BBB通透性改變的程度與再灌注的時(shí)間緊密相關(guān)。再灌注0.5 h時(shí)，BBB的TJ開(kāi)放；再灌注2～6 h時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，胞質(zhì)有吞噬的鑭顆粒，說(shuō)明胞膜的通透性開(kāi)始增大，足突與基底膜開(kāi)始分離，鑭顆粒沉積在細(xì)胞間隙；再灌注12～24 h后，BBB結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量鑭顆粒漏入腦實(shí)質(zhì)；再灌注48 h，內(nèi)皮細(xì)胞不完整，大量神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞壞死崩解，小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿的脂滴和壞死組織形成的類(lèi)似泡沫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)提示組織開(kāi)始修復(fù)。說(shuō)明BBB的通透性在再灌注24 h內(nèi)逐漸升高，在48 h后逐漸降低。腦缺血模型大鼠腦組織ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)顯著減少，EB含量增多，腦水腫程度加重。其原因可能為再灌注增加的炎性因子降低了ZO-1表達(dá)，引起內(nèi)皮細(xì)胞的骨架變化，跨膜蛋白的連接程度變小，BBB通透性改變，局部穩(wěn)態(tài)失衡。與B組比較，C1組和C2組大鼠腦組織EB含量顯著減少，C2組ZO-1陽(yáng)性血管數(shù)顯著增加。表明小牛血清去蛋白可影響ZO-1蛋白表達(dá)，從而維系TJ復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而保護(hù)BBB。

綜上所述，小牛血清去蛋白對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠BBB具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與穩(wěn)定缺血區(qū)腦細(xì)胞和增強(qiáng)ZO-1表達(dá)有關(guān)。