高效液相色譜-蒸發光散射法測定黃氏響聲含片中貝母素甲和貝母素乙含量

陸 丹，趙懿清 ，高秋芳 ，郭衛東，鄒濟高

（1.江蘇省無錫市第三人民醫院，江蘇 無錫 214000； 2.江蘇省無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司，江蘇 無錫 214000）

黃氏響聲含片為復方制劑，由薄荷、浙貝母、連翹、蟬蛻、胖大海、酒大黃、川芎、兒茶、桔梗、訶子肉、甘草、薄荷腦等藥材組方，可疏風清熱、化痰散結、利咽開音。方中浙貝母為君藥，可解毒散結消癰[1]，其主要成分為貝母素甲（浙貝母堿）和貝母素乙（去氫浙貝母堿）[2]。本研究中采用高效液相色譜-蒸發光散射（HPLC-ELSD）法測定黃氏響聲含片中貝母素甲和貝母素乙的含量，為該制劑的質量控制奠定基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括OpenLab工作站（美國Agilent公司）；ALLTECH 3300型蒸發光散射檢測器（美國奧泰科技<中國>有限公司）；BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ250DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W）。

1.2 試藥

黃氏響聲含片（無錫濟民可信山禾藥業股份有限 公 司，批號分別為 171112，171121，171124，171204，171206，171207，180201，180204，180301，180303，180401，180403，180405，規格為每片 0.6 g）；貝母素甲對照品（批號為110750-201612，純度為96.2%）、貝母素乙對照品（批號為110751-201712，純度為97.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini-NX C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（65 ∶35，V/V，含0.035% 二乙胺）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；ELSD參數：漂移管溫度為70℃，載氣流速為1.4 L/min。

2.2 溶液制備

取貝母素甲和貝母素乙對照品各適量，精密稱定，置容量瓶中，加流動相溶解并定容，制成貝母素甲和貝母素乙質量濃度分別為0.515 0 g/L和0.503 1 g/L的對照品貯備液，取適量，制得貝母素甲和貝母素乙質量濃度分別為0.506 4 g/L和0.503 7 g/L的混合對照品溶液。取樣品適量，搗碎，研細，過4號篩，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入濃氨水-乙醇（1∶2，V/V）10 mL，密塞，浸泡 30 min，加乙醚-三氯甲烷-乙醇（50 ∶16 ∶5，V/V/V）混合溶液 25 mL，超聲處理 30 min（控制水溫低于30℃），濾過，濾渣用適量乙醚-三氯甲烷 -乙醇（50∶16∶5，V/V/V）洗滌 3次，合并濾液和洗液，60℃水浴揮干，殘渣用流動相2 mL溶解，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按處方和工藝制備缺浙貝母的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.2項下3種溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。結果理論板數按貝母素甲、貝母素乙峰計均不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好，保留時間分別為6.273 min和7.957 min，對稱因子分別為0.82和0.84。

圖1 高效液相色譜圖

線性關系考察：分別精密量取混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，2.5，4.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制得系列對照品溶液，精密量取20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（μg/mL）的自然對數值（X）為橫坐標、峰面積的自然對數值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得貝母素甲和貝母素乙回歸方程分別為Y甲=1.4647X甲-0.1089（r=0.9998，n=5），Y乙=1.453 6X乙-0.016 0（r=0.999 9，n=5）。結果表明，貝母素甲和貝母素乙質量濃度線性范圍分別為25.32～202.56 μg/mL和25.19～201.48 μg/mL。

定量限與檢測限考察：精密量取混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按擬訂色譜條件進樣測定，以信噪比（S/N）為10∶1和3∶1分別計算定量限、檢測限。結果貝母素甲和貝母素乙的定量限分別為189.9ng和251.9ng，檢測限分別為79.1 ng和75.6 ng。

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為1.51%和0.85%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品（批號為180403）溶液適量，分別于室溫下放置 0，1，2，4，8，12 h，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果貝母素甲和貝母素乙峰面積的RSD分別為2.28%和1.77%（n=6），表明供試品溶液室溫放置12 h內基本穩定。

重復性試驗：稱取樣品（批號為180403）適量，精密稱定，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果貝母素甲和貝母素乙平均含量分別為 36.619 μg/g和 15.677 μg/g，RSD分別為2.47%和2.24%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為180403）6份，每份約2.5 g，精密稱定，分別加入一定質量濃度的對照品溶液，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取13批樣品各適量，同法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果見表2。可見，各批次間貝母素甲和貝母素乙的含量存在一定差異，平均含量分別為0.030 7 mg/g和0.0136 mg/g，RSD分別為10.02%和9.01%，平均總含量為0.0444mg/g，RSD為8.57%；以平均含量的80%制訂含量下限，樣品中貝母素甲、貝母素乙及總含量應分別不低于 0.024 6 mg/g，0.010 9 mg/g，0.035 5 mg/g，各批樣品均符合要求。

表2 樣品含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 分析條件選擇及優化

貝母類生物堿為異甾類生物堿，文獻報道的測定方法有薄層掃描法、HPLC法、柱前衍生化HPLC法、柱前衍生化氣相色譜法[3]、近紅外光譜法[4]、化學發光分析法等[5]。由于貝母素甲無紫外吸收，貝母素乙僅有末端吸收，不宜用紫外檢測器檢測，同時考慮到靈敏度及操作的簡便性，因此采用HPLC-ELSD法分析，效果較佳。

為了降低靈敏度損失，同時使流動相充分揮發，選擇不分流模式。在此基礎上考察漂移管溫度及載氣流速，最終確定漂移管溫度70℃，載氣流速1.4 L/min。

2015年版《中國藥典（一部）》浙貝母藥材和復方黃氏響聲丸項下均采用HPLC-ELSD法測定貝母素甲和貝母素乙的含量，試驗中考察了流動相乙腈-水的比例（70 ∶30，65 ∶35）及二乙胺的加入量（0.030%，0.035%，0.050%）對結果的影響。結果顯示，流動相為乙腈-水（65∶35，V/V，含 0.035%二乙胺）時，待測成分分離良好[1]。

3.2 樣品前處理方法優化 [1，6-15]

以待測成分含量為指標，優化樣品前處理方法。考慮峰面積的適宜性，供試品的取樣量選擇5 g，保持取樣量不變，考察濃氨水-乙醇（1∶2，V/V）混合液的用量為 2，3，5，10，15，20 mL 時的浸泡效果。結果顯示，當用量為20 mL時色譜峰基線不穩，10 mL和15 mL的浸泡效果均較佳，考慮到經濟性，混合液用量選擇10 mL。分別用超聲和加熱回流方式提取供試品溶液，結果兩者提取效果基本一致，超聲提取更簡便，故選擇超聲提取。比較乙醚 -氯仿 -乙醇（50∶16∶5，V/V/V）、三氯甲烷 -甲醇（4∶1，V/V）和流動相為超聲溶劑時的提取效果，結果顯示，用流動相處理的樣品很黏稠，糖類物質被提取出而影響測定，采用乙醚-氯仿-乙醇（50∶16∶5，V/V/V）作為超聲溶劑，提取效果最佳，可滿足測定要求。考察超聲提取溶劑量分別為15，25，50 mL時的提取效果，結果表明，加入混合提取液25 mL即可將貝母素甲、貝母素乙提取完全。設置超聲時間為15，30，45 min，考察提取效果，結果超聲處理30 min即可將貝母素甲、貝母素乙提取完全。比較乙腈、水、甲醇、流動相4種復溶溶劑，結果顯示，貝母素甲、貝母素乙在水中的溶解性較差，水復溶樣品未見出峰，用流動相溶解樣品處理效果最佳，可滿足測定要求。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便、準確，精密度、穩定性、重復性均良好，可用于測定黃氏響聲含片中貝母素甲和貝母素乙的含量。