一種三角帆蚌肌漿網Ca2+-ATP酶基因cDNA的全長克隆與表達分析

張愛菊，劉士力，劉金殿，張根芳，周志明,*

(1.浙江省淡水水產研究所，中國水產科學研究院東海水產研究所浙江研究中心，農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省淡水水產遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001；2. 金華職業技術學院，浙江 金華 321000)

鈣是細胞內重要的信號分子，參與許多基本細胞過程的調控[1-2]。在軟體動物中，Ca2+還是參與其生物礦化過程的重要元素，對珍珠和貝殼的形成及生長非常關鍵。胞內鈣穩態的維持是這些調控或作用正常實現的基礎。在靜息細胞中，細胞內、外的Ca2+含量均是相對穩定的[3]。環境Ca2+濃度是影響育珠蚌鈣代謝的重要原因之一。而軟體動物鈣代謝，對于闡明貝殼以及珍珠形成機理和提高優質珠的產量有著重要意義。直接從環境中吸收鈣是Ca2+進入淡水軟體動物體內的一種重要途徑[4]。因此，溶質鈣外排機制對胞質鈣返回靜止狀態、維持胞內鈣穩態很重要。同時，質膜上和內質網(或肌漿網)上的Ca2+泵將細胞溶質Ca2+排出胞外或進入胞內鈣庫也是維持細胞調控的重要基礎[5-6]。

細胞內Ca2+濃度變化主要由肌漿網(SR)對Ca2+的釋放和攝入來實現[6]。SR是細胞內重要的鈣貯存器，通過調節細胞內Ca2+濃度而發揮重要的生理功能。Sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase(SERCA)是肌漿網膜上的Ca2+泵，靠水解ATP將細胞溶質Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網而將細胞基質中的Ca2+泵入肌質網中儲存起來[7]。迄今為止，有關軟體動物SERCA基因的研究主要集中在合浦珠母貝(Pinctadafucata)、美洲牡蠣(Crassostreavirginica)等海水貝類[8]，而在淡水貝類中鮮有報道。本研究通過RACE技術，成功克隆得到一種淡水貝類——三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)SERCA基因的全長cDNA序列，并分析其核苷酸和氨基酸序列，同時采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術檢測其在不同組織、不同外界Ca2+濃度刺激和同種Ca2+濃度刺激下不同時間的表達情況，以期為進一步深入研究SERCA基因的功能及其調控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用1齡三角帆蚌采自浙江金華威旺養殖新技術有限公司試驗基地，平均殼長65 mm，運回實驗室在PVC塑料箱中暫養1周后隨機選取3只，取其鰓、外套膜、性腺、肝胰腺、斧足等組織，等量相同組織混合在一起經液氮研磨后分裝保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。暫養期間，采用池塘水(綠藻為主)連續充氣養殖，保持水溫(25±1) ℃，pH (7.6±0.1)，每2 d換水1/3。

1.2 總RNA的提取及cDNA首鏈的合成

取三角帆蚌各組織樣品按照TRIzol Reagent(Invitrogen公司)一步法提取總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測總RNA的濃度和質量，同時用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。之后，取各組織總RNA 500 ng按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo公司)說明書，進行反轉錄合成cDNA，保存于-80 ℃備用。

1.3 全長cDNA的克隆

根據三角帆蚌轉錄組高通量測序得到的SERCA部分cDNA序列，設計引物RC126-1F和RC126-1R(表1)。25 μL PCR反應體系：2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL，模板cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后，用PCR產物純化回收試劑盒(生工SK1131)回收、純化。按照克隆試劑盒說明(TaKaRa公司)連接入pMD18-T載體，然后轉化到感受態細胞(SK2301)，經LB平板培養，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序得到600 bp左右的擴增產物，符合預期大小，并經BLAST分析初步確定為SERCA基因的部分序列。

根據已獲得的中間片段，分別設計5’和3’端RACE所需的引物，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。按照Clontech Smart cDNA Amplification kit操作說明書，分別合成5’-RACE Ready-cDNA和3’-RACE-Ready-cDNA作為模板，各進行二輪PCR擴增。第一輪PCR反應體系：2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL，5’-RACE Ready-cDNA或3’-RACE-Ready-cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，ddH2O補足至25 μL。第二輪PCR反應體系：2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)8 μL，第一輪或第二輪PCR稀釋產物1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.5 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應程序、PCR擴增產物的純化、克隆、測序與中間片段所述步驟相同。

1.4 序列分析

測序結果通過DNAStar軟件中的SeqMan程序先進行載體序列的去除和拼接，獲得SERCA基因全長cDNA序列，與GenBank核酸數據庫及蛋白數據庫作BLAST(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析。同時將cDNA序列翻譯成氨基酸序列，應用ORF Finder程序(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)確定正確的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。用ExPASy在線Protparam 程序(http: //www.expasy.org /tools/protparam.html)預測氨基酸序列的物理參數，HMMTOP(Tusndy and Simon 2001)和TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分析跨膜結構，SignalP 3.0 server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽。SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測結構域。用DNAMAN 8軟件對相應的SERCA氨基酸序列進行多重序列比對分析，采用鄰位相接法(neighbor-joining，NJ)構建三角帆蚌SERCA基因氨基酸序列與其他物種的NJ系統進化樹，并用Bootstrap重復1 000次計算各分支的置信度[9]。

1.5 組織差異表達檢測

根據已獲得的全長cDNA序列，設計定量PCR引物SERCA-RTF和SERCA-RTR(表1)。采用qRT-PCR技術檢測三角帆蚌SERCA基因的組織差異，以5種組織(性腺、肝胰臟、斧足、外套膜和鰓)合成的首鏈cDNA為模板，按照FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)說明(Roche公司)，進行qRT-PCR檢測[10]。PCR反應體系：2×qPCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(7.5 μmol·L-1)各1.0 μL，cDNA模板2.5 μL，補足ddH2O至25 μL。程序設置：95 ℃10 min進入循環；95 ℃15 s，60 ℃60 s，72 ℃30 s，共40個循環；72 ℃延伸8 min。

表1三角帆蚌SERCA基因克隆和表達分析的引物

Table1Primers designed for cloning and expression analysis of aSERCAgene forH.cumingii

1.6 環境Ca2+刺激試驗

取15只暫養一周后的三角帆蚌隨機分成5組，分別放入不同Ca2+濃度的20 L PVC塑料箱中，每組3個重復，試驗組在曝氣后的自來水中加入無水氯化鈣，使水體中的Ca2+濃度分別為40、60、80和100 mg·L-1，對照組不添加氯化鈣。在飼養7 d后，分別取三角帆蚌外套膜保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

依據上述試驗結果，另取暫養的三角帆蚌15只，放入Ca2+濃度為60 mg·L-1的塑料箱中，并分別于0、24、48、96和168 h取外套膜保存于-80 ℃超低溫冰箱備用，每次3個重復。采用qRT-PCR技術檢測所取外套膜組織中的SERCA基因表達情況。

1.7 數據分析

進行qRT-PCR檢測時，以NCBI上公布的β-actin(NCBI序列號：HM045420)為內參，用于校正，內參引物見表1。數據繪圖采用Excel 2013軟件。數據基本統計分析、多因素方差分析、相關分析采用SPSS 16.0軟件。qRT-PCR結果用2-ΔΔCT法進行數據處理[11]。

2 結果與分析

2.1 三角帆蚌SERCA基因cDNA全長序列

獲得一種三角帆蚌SERCA基因全長cDNA序列，該基因全長3 326 bp(GenBank 登錄號：KP313822)，包括201-bp 5’-UTR區域、3 060-bp編碼框(ORF)和65-bp 3’-UTR。有1個終止密碼子TGA和一個多聚A尾巴(polyA)，但沒有多聚腺苷酸加尾信號位點(AATAAA)。

2.2 三角帆蚌SERCA氨基酸序列特征

ORF共編碼1 019個氨基酸。通過預測，蛋白質相對分子質量為112.81 ku，分子式：C5052H8029N1325O1484S54，理論等電點(isoelectric point，pI)為5.42。其中，亮氨酸(Leu)含量最高，為8.4%，其次為纈氨酸(Val)，含量為8.1%，色氨酸(Trp)含量最少，為1.4%。帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)122個，帶正電荷氨基酸殘基(Arg + Lys)101個。脂肪族氨基酸指數為96.54。氨基酸預測無信號肽。與其他典型SERCAs不同的是，該三角帆蚌SERCA有9個跨膜區域(圖1)。

SMART分析顯示，三角帆蚌SERCA氨基酸序列呈現出典型的Ca2+-ATP酶特征，由Cation-transporting P-type ATPase, N-terminal (Cation_ATPase_N)、E1-E2 ATPase-associated region(E1-E2_ATPase)、Haloacid dehalogenase-like hydrolase (Hydrolase)、Cation-transporting P-type ATPase， C-terminal (Cation_ATPase_C)四個結構域組成，分別包含77個(殘基1-77)、249個(殘基93-341)、380個(殘基345-724)、173個(殘基819-991)氨基酸殘基。這些結構域中含有SERCAs的常見結構，包括磷酸化區域(phosphorylation region)，異硫氰酸熒光素位點(fluorescein isothiocyanate site)，FSBA結合位點(5′-(p-fluorosulfonyl) benzoyladenosinebinding site)，受磷蛋白結合區(phospholamban-binding motif)以及毒胡蘿卜素位點(thapsigargin sites)(圖1)。

2.3 SERCA氨基酸序列同源性分析和進化樹構建

經NCBI中Protein Blast 比對，與合浦珠母貝(P.fucata)SERCA異構體C和A的相似性最高，均為88%，與鱗硨磲(Tridacnasquamosa)、美洲牡蠣(C.virginica)、大瓶螺(Pomaceacanaliculata)、加洲海兔(Aplysiacalifornica)、蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)、海扇貝(Placopectenmagellanicus)等海洋軟體動物的相似性也很高，依次為87%、87%、86%、85%和85%。此外，同其他一些物種SERCA氨基酸序列也存在不同程度的相似性(表2)，說明SERCA序列高度保守。

用DNAMAN 8軟件將三角帆蚌與其他17種生物的SERCA基因氨基酸序列進行多重比對，并以鄰位相接法(NJ法)構建了氨基酸的進化樹(圖2)。結果表明，系統進化樹可分為明顯的兩大支，其中，紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)占據一個分支，其它SERCA構成另一大分支，三角帆蚌首先與鱗硨磲聚在一起，然后與其他海洋軟體動物，如合浦珠母貝、美洲牡蠣等緊密聚在一起，且與粉正蚓(Lumbricusrubellus)等環節動物親緣關系較近，聚為一支，其系統發育關系基本符合傳統的分類地位。

相同殘基用“*”表示，半保守位置用“﹒”表示；三角帆蚌的跨膜螺旋M1-M9用陰影顯示；磷酸化位點、FITC和FSBA結合位點用下劃線標出；2個典型的胰蛋白酶位點R188和R505用粗體和下劃線標出；典型的受磷蛋白結合區用下劃線加斜體標出；預測的毒胡蘿卜素位點加粗顯示。縮寫及登錄號見表2。Identical residues were shown with an asterisk (*)， and semi-conservative substitutions were labeled with a period (﹒). Transmembrane segments M1-M9 from H.cumingii were shaded in grey. The phosphorylation site， fluorescein isothiocyanate site (FITC) and the 5＇-(p-fluorosulfonyl) benzoyladenosine binding site (FSBA) were underlined and labeled. Two typical tryptic sites R188 and R505 existing in sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA)1 and SERCA2 were marked in bold and underlined. Typical phospholamban-binding motif of SERCA2 was underlined italicized. Putative thapsigargin sites were indicated in bold. The abbreviation name and accession No. were shown as that in Table 2.圖1 預測三角帆蚌SERCA氨基酸序列與合浦珠母貝的序列比對Fig.1 Amino acid sequence alignment of SERCAs from H. cumingii and P. fucata

表2三角帆蚌和其他物種SERCA氨基酸序列的相似性

Table2 Similarity of SERCA amino acid sequence amongH.cumingiiand other species

物種Species中文名Chinese nameGenBank登錄號GenBank accession No.文中縮寫Abbreviation name 相似性Similarity/%Hyriopsis cumingii三角帆蚌AKE25951.1Hc-Eca100Pinctada fucata合浦珠母貝ABS19817.1 Pf-Eca C88Pinctada fucata合浦珠母貝ABS19815.1 Pf-Eca A88Tridacna squamosa鱗硨磲AML22896.1 Ts-Eca87Crassostrea virginica美洲牡蠣XP_022343179.1 Cv-Eca X487Pinctada fucata合浦珠母貝ABS19816.1 Pf-Eca B86Crassostrea virginica 美洲牡蠣XP_022343176.1 Cv-Eca X186Crassostrea virginica美洲牡蠣XP_022343177.1 Cv-Eca X286Pomacea canaliculata大瓶螺XP_025091373.1 Pc-Eca X386Aplysia californica加洲海兔XP_012940855.1 Ac-Eca85Placopecten magellanicus 海扇貝AAC63909.1 Pm-Eca85Mizuhopecten yessoensis 蝦夷扇貝XP_021371547.1 My-Eca X185Crassostrea gigas太平洋牡蠣EKC33522.1 Cg-Eca83Octopus bimaculoides加州雙斑蛸XP_014786351.1 Ob-Eca1-like82Biomphalaria glabrata光滑雙臍螺XP_013087479.1 Bg-Eca1-like82Lingula anatina 海豆芽XP_013421506.1 La-Eca X681Lumbricus rubellus 粉正蚓ACX35339.1 Lr-Ca278Cherax quadricarinatus 紅螯螯蝦AIW68606.1Cq-Eca75

2.4 三角帆蚌SERCA基因的表達特征

圖2 根據SERCA氨基酸序列構建的NJ系統進化樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of SERCA amino acid sequence from H. cumingii and other species

2.4.1 組織表達分析

利用qRT-PCR技術檢測了三角帆蚌SERCA基因在不同組織的表達差異性，結果表明三角帆蚌SERCA表達水平存在明顯的組織差異，在鰓表達最高，其次為外套膜、肝胰腺，在性腺和斧足中的表達量較低(圖3)。

2.4.2 環境Ca2+刺激下的SERCAmRNA表達情況

不同Ca2+濃度處理試驗結果表明，隨水體中Ca2+濃度逐漸升高，三角帆蚌SERCA基因在外套膜中的表達水平呈先下降后上升趨勢，并在Ca2+濃度為60 mg·L-1時達到最低值，Ca2+濃度為80 mg·L-1時達到最高值，且顯著高于其他試驗組(圖4-A)。同時在60 mg·L-1Ca2+濃度條件下，對三角帆蚌外套膜進行不同時間的表達試驗，結果表明，SERCA基因的表達量隨時間推移先上升，于48 h時達到最高，而后逐漸下降，但在168 h時略有上升(圖4-B)。

圖3 三角帆蚌SERCA基因在不同組織中的相對表達量Fig.3 Relative expressions of SERCA gene in different tissues from H. cumingii

A，不同Ca2+濃度下外套膜中SERCA的相對表達量；B，60 mg·L-1 Ca2+濃度條件下外套膜中SERCA在不同時間的相對表達量。柱狀圖上同個系列無相同小寫字母的表示各Ca2+濃度組間差異顯著(P<0.05)；無相同大寫字母的表示時間差異極顯著(P<0.01)。A， The relative expression of SERCA in the mantle under different Ca2+ concentration treatments; B， The temporal expression profile of SERCA under Ca2+ concentration of 60 mg·L-1. The different lowercase letters and capital letters meant significant difference at P<0.05 and P<0.01 respectively.圖4 三角帆蚌SERCA基因的相對表達水平Fig.4 Relative expression level of SERCA detected by real-time PCR from H. cumingii

3 討論

3.1 結構特征

SERCAs屬于P型ATP酶家族，靠水解ATP將細胞溶質Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網而將細胞基質中的Ca2+泵入肌質網中儲存起來[12]。因此，Ca2+轉運功能的變化不僅會直接影響肌肉收縮功能，而且會造成細胞漿中游離Ca2+濃度增加[13]。一般來說，SERCAs由一條單一的多肽鏈組成，形成3個球形的胞漿區域，由螺旋桿部連接到10個跨膜螺旋(M1-M10)。然而，Fan等[8]研究表明，合浦珠母貝的一個SERCA異構體，即PSERB可能擁有11個跨膜區域。與這些SERCAs不同的是，本研究克隆的三角帆蚌SERCA基因氨基酸序列預測有9個跨膜螺旋。

研究認為，哺乳動物和鳥類的SERCA由3個同源基因(SERCA1、SERCA2和SERCA3)編碼，每個基因有多種異構體[14-18]，而一些無脊椎動物中SERCAs的異構體僅由一個基因編碼[19-21]。同時，有學者認為，脊椎動物中的3個SERCA編碼基因和無脊椎動物中的唯一一個SERCA編碼基因由一個共同的SERCA祖基因衍生而來[21]。Fan等[8]的研究表明，合浦珠母貝的SERCA有3個異構體，它們因擁有不同的C末端而被區分[22]。本研究僅克隆了一種三角帆蚌SERCA基因，在氨基酸結構水平上的拼接機制仍需進一步研究。

3.2 組織特異性表達

研究表明，淡水和海水軟體動物都積極地從環境中吸收鈣[4]，但鈣代謝機制存在明顯差異。海水軟體動物外套膜和消化腺中幾乎沒有鈣的存在，不在組織中貯留鈣[23]。而淡水軟體動物吸收的Ca2+有一部分以鈣球體的形式貯藏起來備用[24]。在淡水軟體動物中，斧足是主要運動器官；性腺是生殖系統的重要組成部分；肝胰腺與軟體動物消化、免疫等功能密切相關；外套膜為分泌鈣到礦化位點的重要組織[25]；鰓是從環境中吸收鈣的主要組織[26]。其中，外套膜作為珍珠形成的部位，對Ca2+具有高度通透性[27-28]，其內、外表皮具有主動吸收Ca2+和儲存Ca2+的功能，且Ca2+利用率高[29]；鰓作為三角帆蚌的呼吸和濾食器官，對Ca2+具有較強的親和力和較高的代謝率，是開展鈣代謝過程的重要組織之一。研究表明，相比外套膜，鰓能吸收更多的Ca2+，但其利用率沒有前者高[30]。由此可見，外套膜和鰓的鈣代謝活動旺盛，鈣穩態的維持對它們非常重要。研究表明，PSERB可在多種組織中表達，是一個潛在的“看家基因”，其分布模式與哺乳動物的SERCA2b相似；PSERA可在閉殼肌和斧足中表達，且在閉殼肌中有很高的表達量，可能為肌肉特異性異構體，有助于放松收縮的肌肉[25，31-32]；PSERC可在除閉殼肌和斧足以外的組織中表達，且在鰓和外套膜中有最高的表達水平，這與非肌肉特異性異構體非常相似。在軟體動物中，PSERC在鰓和外套膜中的高度表達可能體現了它在軟體動物生物礦化過程中對鈣穩態的重要性[8]。本研究克隆的三角帆蚌SERCA基因在鰓中表達最高，其次為外套膜、肝胰腺，在性腺和斧足中的表達量較低，說明在外套膜、鰓等鈣代謝活動旺盛的組織中表達量很高，推測該基因在Ca2+吸收、轉運與儲存方面有著重要作用，參與珍珠形成等生物礦化過程。然而，該基因在三角帆蚌外套膜和鰓中的定位仍需進一步研究。此外，該基因在肝胰腺中的表達量也較高，推測肝胰腺也具備儲存Ca2+的功能。性腺和斧足是三角帆蚌的繁殖、運動器官，其中較低的mRNA表達量，可能說明這兩個組織儲存Ca2+的能力較弱。今后將繼續研究該三角帆蚌SERCA基因的異構體種類，進一步了解SERCA基因在維持鈣穩態中的具體功能，掌握鈣吸收、儲藏、轉運機制。

3.3 環境Ca2+刺激

環境鈣濃度是影響育珠蚌鈣代謝的重要原因之一。郝瑩瑩[24]研究結果表明，添加Ca2+時，細胞外Ca2+流動方向是從外排逐步變為內流，并隨濃度增大，Ca2+流動速度增大，細胞內部的熒光信號增強。在調控途徑上，有關鈣代謝的調控因子可能通過鈣的吸收、轉運、貯藏及沉積從而參與和調控貝殼與珍珠的形成。在河蚌育珠過程中，Ca2+的吸收和轉運對于珍珠的產量提高起著重要作用，加快Ca2+在珍珠囊中的沉積，是促進珍珠快速生長的重要手段。在天然水體中，河蚌生存的環境中鈣含量很低，主要是靠外套膜、鰓和斧足等與周圍水環境相接觸的組織直接從環境中吸收鈣，周圍水環境中Ca2+推測是以復合體形式進入細胞內的，因為以游離的離子形態難以直接穿過外套膜表皮細胞的質膜，且要耗費一定的能量，所以部分Ca2+在膜的界面上與離子搬運體結合形成復合體進入質膜[4]。

珍珠的形成是個復雜精細的生物礦化過程，水體中保持適宜的Ca2+濃度，是珍珠生長的必備條件。李文娟等[33]研究認為，適宜的Ca2+濃度能促進三角帆蚌外套膜對Ca2+的吸收、轉運與儲存，而過高的Ca2+濃度則會抑制三角帆蚌外套膜的鈣代謝。舒妙安等[34]研究認為，水體中適宜的Ca2+濃度(40～60 mg·L-1)能促進三角帆蚌的鈣代謝過程，加快珍珠形成。本研究克隆的三角帆蚌SERCA基因在外套膜中的表達水平呈先下降后上升趨勢，并在Ca2+濃度為60 mg·L-1時達到最低值，Ca2+濃度為80 mg·L-1時達到最高值，推測60 mg·L-1Ca2+濃度時外套膜積極地分泌鈣到生物礦化位點參與珍珠生長，導致鈣儲存功能被弱化。當環境Ca2+濃度為80 mg·L-1時，外套膜的分泌功能相對弱化，而儲存功能增強。至于在三角帆蚌不同生長發育階段或外套膜不同位置的表達情況是否一致，還有待進一步研究。此外，本研究還發現三角帆蚌在適宜Ca2+濃度(60 mg·L-1)條件下，其外套膜SERCA基因的表達量隨時間推移先上升，于48 h時達到最高，而后逐漸下降，由此推測48 h轉運、儲存Ca2+能力很強，隨后降低。