堿蓬SgP5CS基因過表達提高擬南芥耐旱性

郭丹丹，楊清華，朱丹華，金杭霞，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華321004； 2.浙江省農業科學院 作物與核技術利用研究所，浙江 杭州310021)

干旱脅迫是影響植物生長的主要非生物脅迫之一，具有重要的農藝學和經濟學意義。氣候變化預測表明，未來干旱事件頻率將會上升[1-2]，因此，增強植物耐旱性使植物適應干旱環境是提高作物產量行之有效的方法之一。植物適應環境脅迫重要的途徑之一是滲透調節，脯氨酸(proline)是重要的滲透調節物質[3-4]，它在穩定膜和細胞結構[5]、保護細胞免受氧化損傷[5-6]和激活植物體內多種反應信號中有著重要作用[7]。

在高等植物中，脯氨酸主要是由谷氨酸通過2種酶作用合成：Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸還原酶(P5CR)[8]。合成過程中，P5CS是催化谷氨酸轉化為δ1-吡咯啉-5-羧酸鹽(P5c)并還原成脯氨酸的關鍵酶。脯氨酸的重要功能在植物應激防御中得到了廣泛的體現，目前已在木薯、蒙古冰草、苜蓿、煙草等植物中發現干旱脅迫下，P5CS基因過表達使植物體內脯氨酸含量上升，增強植物的應急防御能力，提升了植物耐受性[9-12]。

堿蓬(Suaedasalsa)是一種鹽生植物，耐鹽堿、貧瘠，生長于沿海地區。堿蓬對鹽脅迫和干旱脅迫表現出較強的抗逆性，為研究鹽脅迫和抗旱相關基因提供了有價值的材料來源[13]。本研究從堿蓬中克隆出P5CS基因，命名為SgP5CS，將其轉入到擬南芥中，進行表達模式分析和耐旱性鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

堿蓬種植于浙江省農業科學院溫室，光周期16 h/8 h(L/D)，溫度25 °C，生長1個月。用200 mmol·L-1甘露醇處理植株3 d，采集處理后的堿蓬和未經處理的堿蓬(對照)葉片，立即冷凍并保存在液氮中以備提取RNA；將生長7 d的轉基因擬南芥幼苗分別用0 mmol·L-1(對照)和200 mmol·L-1甘露醇進行干旱脅迫2周。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取、cDNA合成和qPCR分析

以經過干旱處理3 d的堿蓬葉片為材料，采用Trizol法[14]提取總RNA，-70 ℃保存。GenBank數據庫查找已有的大豆、水稻等植物的Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶序列，用Clustalw2多序列比對后，設計包含完整開放閱讀框(ORF)的簡并引物SgP5CS-F(5’-ATGGACGCKWCTAGAGYYTTCGT-3’)和SgP5CS-R(5’-AGGCAGCGGGAGAGAGGACAAGAA-3’)。通過逆轉錄試劑盒(TOYOBO公司)合成cDNA第1條鏈。以cDNA為模板使用Pfu酶(TRANSGEN BIOTECH公司)進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物并回收目的條帶。使用Roche LightCycler? 480 II定量PCR儀對SgP5CS基因的表達進行檢測。

1.2.2SgP5CS基因表達載體構建和擬南芥轉化

參照金杭霞等[15]的方法進行表達載體的構建。將含SgP5CS的pEASY-Blunt質粒和pCAMBIA1301-gfp空載體分別雙酶切(SacⅠ內切酶+BamH Ⅰ內切酶)。酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，用DNA凝膠回收試劑盒回收大小約2 100 bp的目的條帶和大小約14 kb左右的pCAMBIA1301-gfp載體片段。T4-DNA連接酶將2個DNA回收片段在室溫條件下連接過夜。利用凍融法將重組質粒轉入大腸埃希菌DH5α中，涂布LB平板(含100 mg·L-1卡那霉素)，37 ℃培養12～16 h，挑單菌落搖菌、抽提質粒，經SacⅠ和BamH Ⅰ雙酶切驗證后送測序公司測序。測序驗證后，命名為SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp。將SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp重組質粒利用凍融法轉化農桿菌EHA105，涂布LB平板(含50 mg·L-1利福平和100 mg·L-1卡那霉素)，28 ℃條件下培養形成菌落，挑單菌落進行PCR驗證、抽提質粒、雙酶切驗證。

利用花序浸染法分別將含有重組質粒SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp和pCAMBIA1301-gfp空載體的農桿菌轉化擬南芥。T0代轉基因擬南芥種子在含有50 mg·L-1潮霉素的MS培養基上篩選，選取抗性苗移植，PCR檢測為陽性的轉基因苗溫室培養后收獲T1代種子。

1.2.3 轉基因擬南芥鑒定

在含50 mg·L-1潮霉素的MS培養基上篩選出SgP5CS過表達轉基因株系，在16 h/8h(L/D)光暗周期，25 °C室內培養。提取篩選到的擬南芥抗性苗總RNA，以此為qRT-PCR模板，利用SgP5CS150-F(5’-TGGACCTGACCTCTGC-3’)和SgP5CS150-R(5’-CTTTCCTGGTACTTACTGC-3’)特異引物進行擴增，鑒定轉基因擬南芥植株。

1.2.4 轉基因擬南芥耐旱性和生理指標的測定

將T2代轉基因擬南芥株系和對照組(轉pCAMBIA1301-gfp空質粒擬南芥植株)種子表面滅菌，播種于含50 mg·L-1潮霉素的固體MS培養基上。7 d后，選擇具有同等生長活力和長勢一致的幼苗，分別移植到含0和200 mmol·L-1甘露醇的固體MS培養基上，2周后每個株系分別測定30株擬南芥的根長，并觀察植株整體生長狀態。脯氨酸含量測定采用茚三酮顯色法[16]，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定使用硫代巴比妥酸法[17-18]。

1.2.5 數據分析

實驗數據采用Origin Pro 6進行統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下SgP5CS基因在堿蓬中的表達分析

為了探究SgP5CS是否受到非生物脅迫的誘導，對堿蓬幼苗進行了3 d干旱脅迫(200 mmol·L-1甘露醇)。通過qRT-PCR方法測定基因表達量，結果如圖1所示。SgP5CS基因在干旱脅迫條件下表達水平是對照的43.7倍，具有極顯著差異(P<0.01)，說明干旱脅迫可顯著誘導SgP5CS的表達。

2.2 SgP5CS基因植物表達載體的構建與驗證

將含SgP5CS的pEASY-Blunt質粒和pCAMBIA1301-gfp空載體分別雙酶切，回收片段再連接，最終使SgP5CS的ORF插入到pCAMBIA1301-gfp載體的組成型表達啟動子35S之后。構建的重組表達載體SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp經限制性內切酶SacⅠ、BamH Ⅰ雙酶切后，得到2個不同大小的DNA片段，其中SgP5CS基因片段約2 100 bp(圖2)。對酶切的載體再次測序驗證，顯示插入的片段序列與第1次測序結果相同，表明SgP5CS的ORF已經插入到質粒pCAMBIA1301-gfp中，說明植物雙元表達載體SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp構建成功。

**表示與對照差異極顯著(P<0.01)。下同。** indicated significant difference at 0.01 level compared with control group. The same as bellow.圖1 干旱脅迫誘導SgP5CS基因表達分析Fig.1 Analysis of SgP5CS gene expression induced by drought stress

2.3 SgP5CS基因轉擬南芥植株的獲得和篩選

利用花序侵染法將載體SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp和空載體轉入擬南芥，獲得了轉SgP5CS基因和轉空載體(CK)T0代擬南芥種子，在含有50 mg·L-1潮霉素的MS培養基上篩選10 d后，選取抗性苗移植。對4株已開花的T1代擬南芥植株進行PCR驗證，以轉空載體的擬南芥植株為陰性對照，在4株抗性苗中都擴增出了約2 100 bp的DNA條帶，而陰性對照未擴增出相應條帶(圖3)。

2.4 SgP5CS在轉基因擬南芥中的表達

利用qRT-PCR方法對T2代轉基因擬南芥幼苗進行檢測，結果顯示，相同濃度干旱脅迫下，轉基因擬南芥P1、P2和P3株系中均檢測到SgP5CS基因的表達且表達量顯著上調，尤其P3株系表達量極顯著高于對照(P<0.01)，而在轉空載體對照組中未檢測到SgP5CS基因(圖4)。

2.5 SgP5CS的過表達對轉基因擬南芥耐旱性的影響

分別對SgP5CS過表達轉基因擬南芥株系P1、P2、P3和轉空載體的對照植株進行干旱(MS+200 mmol·L-1甘露醇)和正常條件(MS)處理。2周后，干旱脅迫下轉SgP5CS基因擬南芥株系

1，DNA marker；2，SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp酶切結果。1， DNA marker；2， Digestion results of SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp. 圖2 SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp重組質粒雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion of recombinant plasmid SgP5CS-pCAMBIA1301-gfp

1，DNA marker；2～5，轉SgP5CS基因擬南芥植株；6，陰性對照。1， DNA marker; 2-5，Transgenic Arabidopsis plants with SgP5CS gene; 6， Negative control.圖3 SgP5CS轉基因擬南芥PCR檢測電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR amplification products of SgP5CS transgenic Arabidopsis

CK，轉空載體擬南芥植株；P1～P3，轉SgP5CS基因擬南芥植株。下同。CK， Transgenic Arabidopsis line with empty plasmid; P1-P3， Transgenic Arabidopsis plants with SgP5CS gene. The same as bellow.圖4 干旱脅迫誘導擬南芥中SgP5CS基因表達分析Fig.4 Analysis of SgP5CS gene expression in Arabidopsis induced by drought stress

P1、P2和P3的根系長度與對照相比均極顯著增加(圖5)，分別是對照的3.75、3.35和4.63倍。干旱脅迫下植株的根系長度均低于正常條件下，其中，對照植株在干旱處理下根系長度僅為正常條件下生長的17.12%，P1、P2和P3植株分別為65.8%、59.52%和77.27%。同時，在未添加甘露醇的MS培養基上，由根系長度可以看出，P1、P2、P3生長狀況與對照相似(圖5、圖6-a)；而干旱條件下生長狀況差異明顯，SgP5CS過表達轉基因擬南芥株系的生長狀況明顯優于對照，對照植株受脅迫影響明顯，表現出嚴重受損癥狀(圖6-b)。結果說明SgP5CS過表達轉基因擬南芥對干旱脅迫的耐受性更強。

圖5 干旱脅迫對轉SgP5CS基因擬南芥根長的影響Fig.5 Effects of drought stress on root length of transgenic Arabidopsis with SgP5CS Gene

圖6 轉SgP5CS基因擬南芥和CK干旱脅迫下的生長狀況Fig.6 Effects of drought stress on the growth of transgenic Arabidopsis with SgP5CS gene and empty plasmid

2.6 丙二醛和游離脯氨酸含量變化

干旱脅迫(200 mmol·L-1甘露醇)2周后，SgP5CS基因過表達擬南芥株系P1、P2和P3中游離脯氨酸含量升高，與對照具有極顯著差異(P<0.01)，分別是對照植株的1.61、1.45和1.73倍；在正常條件下SgP5CS基因過表達擬南芥植株的脯氨酸含量與對照植株無明顯差異，所有植株干旱脅迫后脯氨酸含量均高于正常條件下生長的植株(圖7)。丙二醛含量是衡量植物對極端環境的耐受性指標[19]，結果表明，干旱脅迫下丙二醛含量與對照相比極顯著下降(圖8)，分別下降了50.02%、54.35%和74.51%，尤其P3植株中含量僅為對照的25.49%。結果顯示：生長狀況明顯優于對照的轉基因擬南芥體內的脯氨酸水平較高，丙二醛含量較低，而表現出嚴重受損癥狀的對照植株相反，表明干旱脅迫下轉SgP5CS基因擬南芥與對照相比表現出較強的耐旱能力。

圖7 干旱脅迫對轉基因擬南芥脯氨酸含量影響Fig.7 Effects of drought stress on proline content in transgenic Arabidopsis

圖8 干旱脅迫對轉基因擬南芥丙二醛含量影響Fig.8 Effects of drought stress on malondialdehyde content in transgenic Arabidopsis

3 討論

在高等植物中，脯氨酸在各種脅迫反應中起著關鍵作用，如應對高鹽[20]、缺水[12]、極端溫度[21]和重金屬毒性[22]等。脯氨酸積累、P5CS基因過表達和對非生物脅迫的耐受性之間的關系已在許多實驗中得到充分證明。P5CS基因受特異性調控，可被干旱、鹽度、ABA誘導[23]，鹽脅迫下編碼P5CS的基因表達上調，合成更多的脯氨酸幫助植物抵抗滲透失衡的變化[24]。過表達P5CS基因的植物，包括小麥、甘蔗、水稻、馬鈴薯、柑橘和鷹嘴豆等[25-30]，體內脯氨酸積累可以降低脂質過氧化程度，維持細胞結構的完整性來增強植物的應急防御能力，使植物在不同的脅迫環境下維持基本的生理過程。本研究發現，轉基因擬南芥SgP5CS基因的表達明顯受到干旱脅迫的誘導，這與黃文華[31]對蒙古冰草干旱脅迫下P5CS基因定量表達分析結果一致。

植物主要通過根系來維持自身的生長需求，植物根系脯氨酸的運輸和積累可以在極端的環境下通過不同調控途徑來促進植株的根系生長[32]。在鹽脅迫和干旱脅迫條件下，豇豆P5CS基因在鷹嘴豆和高粱中過表達，脯氨酸含量增加進而促進植物根系伸長和根系生物量增加[30，33]。干旱脅迫會引起植物體內代謝和氧化反應等方面的變化，適量的脯氨酸積累能夠使植物對有限的環境條件具備一定的適應能力，這對植物生長具有重要的意義[34]。

本研究克隆堿蓬SgP5CS基因并導入到擬南芥中，使SgP5CS基因在擬南芥過表達后進行相關的指標測定和耐旱性鑒定，結果顯示，經干旱脅迫誘導2周后，SgP5CS過表達的擬南芥植株的表現優于對照，具有較長的根系，同時游離脯氨酸的含量顯著增加而丙二醛含量顯著降低。總之，SgP5CS基因在擬南芥中過表達能夠增強擬南芥耐旱性，但SgP5CS基因在干旱脅迫下的調控機制有待進一步研究。