雙重RT-RPA法快速檢測沙門氏菌及其1類整合酶基因

程 輝，梁 奕，俞圣韜，葉仲杜，蔣 晗，朱 誠，*

(1.浙江省海洋食品品質及危害物控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310018； 2.中國計量大學 生命科學學院，浙江 杭州 310018)

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科的一類革蘭氏陰性菌，它是全球最重要的食源性致病菌之一，且被世界衛生組織 (World Health Organization， WHO)列為具有中等乃至嚴重危害的食源性病原菌[1]。據文獻報道，越來越多的沙門氏菌在致病的同時，具有多重耐藥性[2-4]，其攜帶的耐藥基因可以通過水平基因轉移(horizontal gene transmission， HGT)等方式遷移擴散[5]，嚴重危害人類健康，其中整合酶基因(integrase gene，intI)尤其是1類整合酶基因(intI1)在此擴散中發揮關鍵作用[6]。因此，建立一種快速、準確、高效且可同時檢測沙門氏菌及其耐藥相關整合酶基因的方法，對于食品安全保障和細菌耐藥性防控具有重要意義。

針對沙門氏菌和intI1基因，研究人員已開展了常規PCR、熒光定量PCR、環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification， LAMP)等研究[7-10]，其中PCR方法雖靈敏度高，但檢測效率較低；LAMP方法雖用時短且擺脫了對儀器的依賴，但假陽性高，極易污染[11]。重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種在常溫下可以使核酸快速擴增的方法。在25～42 ℃等溫條件下，重組酶uvsX與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全互補的序列時，在單鏈DNA結合蛋白的作用下，使模板DNA解鏈，并在鏈置換DNA聚合酶Bsu的作用下，形成新的DNA互補鏈，被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩條引物起始一個合成事件，整個過程進行得非常快，一般在30 min內即能獲得可檢出水平的擴增產物[12-16]。本文所采用的熒光定量重組酶聚合酶擴增(duplex real-time RPA， RT-RPA)方法，可在常溫下高速擴增沙門氏菌的特異基因fimY和1類耐藥相關整合酶基因intI1，其關鍵技術在于exo探針的設計，該方法特異性強、靈敏度高、速度快(檢測時間20 min)，在實際樣品檢測試驗中準確率高。這對沙門氏菌及其耐藥性相關整合子基因的快速檢測、早期預警、切斷傳播途徑從而保障人類安全健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌株

腸炎沙門氏菌SalmonellaenteritidisGIMCC1.345、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusGIMCC1.142、阪崎腸桿菌CronobacterSakazakiiGIMCC1.296、志賀氏菌Shigellaspp. GIMCC1.424均購自廣東省微生物菌種保藏中心。β溶血性鏈球菌StreptococcushemolyticusATCC21059、副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802、單增李斯特菌ListeriamonocytogenesATCC19115均購自美國典型培養物保藏中心。實際樣品檢測試驗中，2株攜帶intI1基因的沙門氏菌，555株攜帶intI1基因的大腸埃希菌從生豬養殖場、屠宰場、超市和農貿市場篩選得到[17]。所有微生物實驗均在Ⅱ級生物安全實驗室完成。培養基均購自杭州微生物試劑有限公司。分子相關試劑均購自北京百泰克生物技術有限公司。其他化學試劑均購自Sigma。

1.2 儀器與設備

美國Bio-Rad CFX 96熒光定量PCR儀、美國Thermal離心機、美國Bio-Rad PCR儀、美國Bio-Rad電泳儀、美國Bio-Rad凝膠成像分析系統等。

1.3 引物與探針

根據大腸埃希菌uidA基因(GenBank登錄號：S69414)，沙門氏菌fimY基因(GenBank登錄號：JQ665438)、intI1基因(GenBank登錄號：HM569736)，設計PCR引物、熒光定量PCR引物、RPA引物和exo探針(表1)，exo探針中間標記熒光基團和熒光淬滅基團，插入四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)基團(圖1)。

1.4 細菌培養與基因組提取

在-80 ℃ 冰箱中取出實驗室凍存的沙門氏菌菌種進行復蘇培養，隨后劃線接種于亞硫酸鉍培養基，于37 ℃過夜培養。挑取單菌落于亞硫酸鉍培養基中，于37 ℃，200 r·min-1培養至菌液D600值為1.0。其余菌株在各自最適條件下培養。需檢測的革蘭氏陰性菌菌液采用煮沸法制備菌液模板DNA。取1 μL待測菌液加入30 μL Tris緩沖液，煮沸5 min，冰上冷卻2 min，12 000×g離心2 min，取上清液用作DNA模板。革蘭氏陽性菌模板DNA采用試劑盒法，操作按試劑盒操作說明進行。

表1引物和探針序列

Table1Sequences of primers and exo probes

圖1 RPA exo探針設計圖Fig.1 Exo probe of RPA

1.5 濃度梯度樣品稀釋

取D600為1.0的腸炎沙門氏菌培養液、實驗室篩選到的攜帶intI1的大腸埃希菌培養液各1 mL，按照10倍梯度進行稀釋并進行平板活菌計數，每組濃度3個平行，取平均值計算原液中的細菌濃度。將經活菌計數的腸炎沙門氏菌培養液、攜帶intI1基因的大腸埃希菌培養液，分別進行10倍梯度稀釋，分別提取DNA，獲得腸炎沙門氏菌、攜帶intI1基因的大腸埃希菌的系列濃度梯度標準品(108～100CFU·mL-1)。

1.6 RPA方法的建立與優化

50 μL RPA反應體系包含2× RE緩沖液25 μL，250 mmol·L-1醋酸鎂溶液2.5 μL，2 μL的primerF和primerR，1 μL的exo探針和2 μL的DNA模板和2 μL酶工作液。反應程序為37 ℃ 反應20 min (30 s一個循環，每個循環收集1次熒光)，反應過程借助熒光定量PCR儀實時監測。為獲得較優的結果，對雙重RT-RPA的引物和探針濃度、反應溫度進行了優化，反應溫度從30 ℃到41 ℃進行梯度優化，引物和探針濃度按表2所示濃度進行優化。

1.7 特異性實驗

使用雙蒸水作為陰性對照，分別使用沙門氏菌、副溶血性弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、β溶血性鏈球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、攜帶intI1基因的大腸埃希菌、大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21、攜帶intI1基因的沙門氏菌等11種菌種基因組DNA作為模板，反應體系采用前期實驗優化后的RPA體系，進行RT-RPA特異性驗證。

1.8 靈敏度實驗

以1.5節制備的標準品為模板，在最佳條件下進行RT-RPA反應，以檢驗反應靈敏度，并與常規RT-PCR靈敏度進行比較分析。

1.9 雙重RT-RPA方法在實際菌株鑒定中的應用

參照GB 4789.38—2012《食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數》、GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》中的方法，從養豬場、屠宰場、農貿市場和超市環境樣品與豬肉樣品分離耐藥性大腸埃希菌和沙門氏菌，并參照Zhu等[18]的方法對intI1基因進行鑒定。對比選擇性平板培養、FDA推薦的微生物分析法[19]、PCR擴增和RT-RPA擴增等方法進行菌株結果鑒定。

2 結果與分析

2.1 RPA檢測方法的建立與雙重RT-RPA的優化

分別以陽性沙門氏菌基因組DNA和攜帶intI1基因的耐藥大腸埃希菌為模板，篩選RT-RPA引物探針組合、優化單重RT-RPA的反應溫度、探針濃度，建立最優的單重RT-RPA反應體系。結果顯示：沙門氏菌RT-RPA引物探針組合1優于組合2，intI1引物探針組合1優于組合2(圖2-A)，選擇引物探針組合1進行后續的RT-RPA實驗。

設置30～41 ℃的溫度梯度 (30.0 ℃、30.7 ℃、32.1 ℃、34.3 ℃、36.9 ℃、39.1 ℃、40.3 ℃、41 ℃)，優化RT-RPA反應溫度，結果顯示，反應溫度為36.9 ℃時，兩組RT-RPA反應均有較好的擴增(圖2-B和圖2-C)。優化exo探針濃度優化試驗結果顯示，fimY探針濃度為60 nmol·L-1時，檢測fimY效率較高，intI1探針濃度為100 nmol·L-1時，檢測intI1效率較高。在單重RT-RPA優化條件的基礎上，進行雙重RT-RPA引物和探針濃度優化，結果顯示，當fimY引物終濃度為320 nmol·L-1，intI1引物400 nmol·L-1，fimY探針終濃度為60 nmol·L-1，intI1探針終濃度為100 nmol·L-1時，fimY和intI1同步檢測效果最優(表2)。

2.2 特異性實驗

按照1.7節特異性實驗的方法進行檢測，如圖3-A所示，經過雙重RT-RPA檢測，在添加有沙門氏菌、攜帶intI1基因的沙門氏菌、攜帶intI1基因的大腸埃希菌樣品中均出現明顯的擴增曲線，且攜帶intI1基因的沙門氏菌出現2條擴增曲線，顯示為陽性。添加其他干擾菌的樣品均無明顯擴增，結果為陰性。實驗結果表明：本研究建立的多重熒光定量檢測方法對沙門氏菌及其耐藥相關intI1基因有較好的特異性，與其他相關細菌無交叉反應。

2.3 靈敏度實驗

按照1.8節靈敏度實驗的方法進行檢測，對濃度為1.29×105、1.29×104、1.29×103、1.29×102、1.29×101、1.29×100CFU·mL-1的沙門氏菌進行RT-RPA和熒光定量PCR檢測，對濃度為1.60×105、1.60×104、1.60×103、1.60×102、1.60×101、1.60×100CFU·mL-1的intI1基因進行RT-RPA和熒光定量PCR檢測。結果表明，RT-RPA方法對沙門氏菌檢測下限為1.29×101CFU·mL-1，對intI1基因檢測下限為1.60×101CFU·mL-1(圖3-B和圖3-C)，與常規RT-PCR的檢測靈敏度一致(圖3-D和圖3-E)。

2.4 實驗樣品的檢測

A: 1，fimY引物探針組合1；2，intI1引物探針組合1；3，fimY引物探針組合2；4，intI1引物探針組合2。B、C: 1，溫度36.9 ℃。A: 1， The first combination of fimY primer and probe; 2， The first combination of intI1 primer and probe; 3， The second combination of fimY primer and probe; 4， The second combination of intI1 primer and probe. B and C: 1, The temperature is 36.9 ℃.圖2 RT-RPA反應條件優化Fig.2 Optimization of reaction for RT-RPA

表2雙重RT-RPA引物與探針濃度優化

Table2Optimization of primers and probes concentration for duplex RT-RPA

組合Group引物濃度Concentration of primers/(nmol·L-1)fimYintI1探針濃度Concentration of probes/(nmol·L-1)fimYintI1Ct值Ct valuefimYintI1140040012012019.48—24004006010019.9721.5033204006010018.1219.4843203206010022.3124.6452403206010023.0425.816240240608025.2827.157160240608028.6128.008160160406030.2230.73980160404035.05—

如表3所示，雙重RT-RPA方法對在豬肉生產鏈中篩選到的沙門氏菌、大腸埃希菌及其攜帶intI1基因的檢測結果與FDA推薦的微生物分析法[18]、PCR法檢測結果一致，但雙重RT-RPA方法的檢出時間較微生物分析法、PCR法有明顯縮短。微生物分析法需過夜培養，PCR法鑒定需要2 h以上，RT-RPA可以在20 min完成檢測。此外，RT-RPA結果直接通過擴增曲線判定，不需要開蓋電泳，故與PCR產物電泳鑒定方法相比，降低了擴增產物對環境的污染，這對降低因環境污染導致的假陽性率大有裨益。

3 結論

本研究以RPA方法為技術基礎，建立了一種能單管同時快速鑒定沙門氏菌及其耐藥相關intI1基因的雙重RT-RPA方法。該方法以沙門氏菌特異毒力基因fimY和細菌耐藥相關1類整合酶基因intI1為靶標序列，建立了基于exo探針的雙重RT-RPA方法，當fimY引物終濃度320 nmol·L-1，intI1引物終濃度400 nmol·L-1，fimY探針終濃度60 nmol·L-1，intI1探針終濃度100 nmol·L-1，反應溫度37 ℃，反應20 min 時，雙重RT-RPA擴增效率最高，且特異性好，靈敏度高。實際應用中，該方法檢測準確率高。

A: 1-1，攜帶intI1基因的沙門氏菌fimY基因擴增曲線；1-2，攜帶intI1基因的沙門氏菌intI1基因擴增曲線；2，沙門氏菌；3，攜帶intI1基因的大腸埃希菌；4-11，副溶血弧菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、β溶血性鏈球菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21；12,陰性對照。B: 1，1.29×105 CFU·mL-1；2，1.29×104 CFU·mL-1；3，1.29×103 CFU·mL-1；4，1.29×102 CFU·mL-1；5，1.29×101 CFU·mL-1；6，1.29×100 v·mL-1。 C: 1，1.60×105 CFU·mL-1；2，1.60×104 CFU·mL-1；3，1.60×103 CFU·mL-1；4，1.60×102 CFU·mL-1；5，1.60×101 CFU·mL-1；6，1.60×100 CFU·mL-1。D: fimY基因常規RT-PCR靈敏度試驗，1，1.29×105 CFU·mL-1；2，1.29×104 CFU·mL-1；3，1.29×103 CFU·mL-1；4，1.29×102 CFU·mL-1；5，1.29×101 CFU·mL-1；6，1.29×100 CFU·mL-1。E: intI1基因常規RT-PCR靈敏度試驗，1，1.29×105 CFU·mL-1；2，1.29×104 CFU·mL-1；3，1.29×103 CFU·mL-1；4，1.29×102 CFU·mL-1；5，1.29×101 CFU·mL-1；6，1.29×100 CFU·mL-1。A: 1， Amplification of fimY(intI1-positive salmonella); 1-2， Amplification of intI1 (intI1-positive salmonella); 2， Salmonella; 3， IntI1-positive E.coli; 4-11， Vibrio parahaemolyticus， Shigella， Staphylococcus aureus， β-hemolytic streptococcus， Listeria monocytogenes， Enterobacter sakazakii， E. coli DH5α， E. coli BL21; 12, Negative sample. B: 1， 1.29×105 CFU·mL-1; 2， 1.29×104 CFU·mL-1; 3， 1.29×103 CFU·mL-1; 4， 1.29×102 CFU·mL-1; 5， 1.29×101 CFU·mL-1; 6， 1.29×100 CFU·mL-1. C: 1， 1.60×105 CFU·mL-1; 2， 1.60×104 CFU·mL-1; 3， 1.60×103 CFU·mL-1; 4， 1.60×102 CFU·mL-1; 5， 1.60×101 CFU·mL-1; 6， 1.60×100 CFU·mL-1. D: Sensitivity of RT-PCR for fimY， 1， 1.29×105 CFU·mL-1; 2, 1.29×104 CFU·mL-1; 3, 1.29×103 CFU·mL-1; 4, 1.29×102 CFU·mL-1; 5, 1.29×101 CFU·mL-1; 6， 1.29×100 CFU·mL-1. E: Sensitivity of RT-PCR for intI1， 1， 1.29×105 CFU·mL-1; 2， 1.29×104 CFU·mL-1; 3， 1.29×103 CFU·mL-1; 4， 1.29×102 CFU·mL-1; 5， 1.29×101 CFU·mL-1; 6， 1.29×100 CFU·mL-1.圖3 RT-RPA特異性與常規RT-PCR靈敏度Fig.3 Specificity and sensitivity of RT-RPA and RT-PCR

A: uidA基因、fimY基因、intI1基因PCR電泳結果，M為DL 2 000 marker；1為攜帶有intI1基因的沙門氏菌；2為不攜帶intI1基因的沙門氏菌；3為攜帶有intI1基因的大腸埃希菌；4為陰性對照。B：大腸埃希菌和沙門氏菌選擇性培養結果，大腸埃希菌在伊紅美藍選擇性平板上為綠色金屬光澤菌落，沙門氏菌在亞硫酸鉍選擇性平板上為灰色金屬光澤菌落。C: RT-RPA鑒定結果，1為攜帶有intI1基因的沙門氏菌；2為不攜帶intI1基因的沙門氏菌；3為攜帶有intI1基因的大腸埃希菌；4為陰性對照。A: uidA， fimY and intI1 of PCR， M represented DL 2 000 marker; Lane 1 represented intI1-positive Salmonella; Lane 2 represented intI1-negative Salmonella; Lane 3 represented intI1-positive E.coli; Lane 4 represented negative control. B: Selective plate for E. coli and Salmonella， E. coli was green metallic luster colony on the EMB plate， and Salmonella was gray metallic luster colony on the BS plate. C: Lane 1 represented intI1-positive Salmonella; Lane 2 represented intI1-negative Salmonella; Lane 3 represented intI1-positive E.coli; Lane 4 represented negative control.圖4 不同方法在菌株和intI1基因鑒定中的應用Fig.4 Application of different methods in identification of strains and intI1 gene

表3RT-RPA方法在菌株及intI1基因鑒定中的應用

Table3Application of RT-RPA method in identification of strains andintI1 gene

目標菌株Target isolates鑒定結果Identification results/strain選擇性培養法Selective culturePCRRT-RPA細菌培養法Bacterium culture大腸埃希菌Escherichia coli14601038—1038沙門氏菌Salmonella168616161攜帶intI1大腸埃希菌intI1-positive Escherichia coli—555555—攜帶intI1沙門氏菌intI1-positive Salmonella—22—

本研究將RT-RPA方法應用到耐藥性相關1類整合酶基因的檢測，并實現了對沙門氏菌和1類整合酶基因的雙重同步檢測。該方法檢測時間只需20 min，較傳統的方法大大縮短。該方法的建立對沙門氏菌及其耐藥性相關整合子基因的快速檢測、早期預警、切斷傳播途徑進而保障人們安全健康具有重要意義。也可為食品中其他致病微生物及其耐藥性的快速檢測研究提供借鑒，使食品中致病微生物及其耐藥性檢測向高通量、高靈敏、簡便經濟的方向發展。