納米藥物載體的結構修飾實現內體逃逸

李成龍，李榮燁，云 鵬，張冠宏，郗來順，王元斗，宿 烽

(1.青島科技大學化工學院，山東 青島 266042)(2.勝利油田中心醫院，山東 東營，257000)

1 前 言

納米載體作為一種亞微粒輸送系統，能大大提高藥物的吸收度和穩定性，改善藥物性質和靶向性，加快基因轉染速率，延長作用時間，增加療效，已廣泛應用于腫瘤、血管疾病的治療[1, 2]。目前廣泛應用的納米載體主要包括膠束、脂質體、樹枝狀大分子、聚合物納米顆粒等[1, 3, 4]，其包載藥物進入機體，通過調節載體的表面電荷、粒徑大小或與相應配體結合等方式突破細胞膜[5, 6]；在跨膜過程中形成內涵體，隨著內涵體被溶酶體內吞，進入到溶酶體[3, 4, 7]。一般載體會因為在內體中的長時間停留，由于內涵體/溶酶體內酸性環境(pH約4.0～6.0)及大量酶的存在導致載體水解，造成包載物質的滲漏，改變其結構、穩定性，嚴重影響所包載藥物的治療效果[8, 9]，如圖1所示。因此，針對內體逃逸的機制，研究人員對藥物載體材料進行結構修飾，從而達到內體逃逸的目的，提高藥物療效，降低藥物毒副作用[10]。

2 藥物載體內體逃逸的方式

藥物載體經過內吞進入細胞，由于內吞胞質的pH值從早期內涵體(pH 5.5～6.5)到晚期內涵體(pH 4.5～5.5)，最后到溶酶體(pH<5)，呈現出逐漸降低的過程[11]，因此，藥物載體可通過與內體逃逸劑結合實現內體逃逸。常用內體逃逸劑如表1所示。

圖1 胞吞及內體逃逸示意圖[7]：通過內吞途徑進入細胞的粒子被包裹在小泡中，形成早期內涵體、晚期內涵體，最后發展為溶酶體。在此過程中胞內物質實現內體逃逸，發揮作用；反之，在溶酶體中被酶降解Fig.1 Schematic of endocytosis and endosomal escape[7]:particles entered the cells via the endocytic pathway become entrapped in the visicles, the vesicles matured form early endosomes and late endosomes and eventually end up in the lysosome, the particles are effective by achieving the endosome escape; otherwise, enzymatic degradation processes take place

2.1 利用質子化效應脹破內體膜

質子化效應是通過具有高緩沖能力的質子化劑介導，在質子化時，能夠自由膨脹，使得內體內滲透壓升高，引起大量的水和離子內流進入內體，導致內體膜脹破，從而將內體內包裹的物質釋放，實現內體逃逸[12]，如圖2所示。有研究表明，叔胺基團能在酸性條件下吸附質子，使物質免受酸性環境的影響，同時其質子化介導能力會增大內體滲透壓，脹破內體膜，將物質從內體中釋放出來[13]。另有研究表明，富含組氨酸的分子由于咪唑基的存在，具有很好的質子介導作用，也會導致內體膜的破裂[14]。

2.2 通過膜的融合實現跨膜

另一種內體逃逸機制是實現膜的融合，降低內體膜的穩定性[12]。對細胞而言，細胞膜由磷脂雙分子層構成，膜內是疏水環境，而膜兩側為水環境。而α-螺旋類似于DNA雙螺旋，具有NCCNCCNCC骨架結構，能夠將疏水基團放在骨架外側，將親水基團置于內側，膜蛋白能夠以α-螺旋實現單次或多次跨膜[15]。

2.3 通過形成膜孔穿過內體膜

通常，孔的形成是基于膜張力和線張力之間的相互作用(圖3)。膜張力大形成孔，線張力大關閉孔。多肽的一些組件和孔的邊緣具有較高的親和力，故將多肽結合到聚合物表面可以減少線張力，從而增加孔的形成數量，保持孔徑的穩定[16]。如將陽離子兩親性多肽(AMPs)與脂質雙分子層結合即會導致其內部應力和內膜張力的增加，足夠使膜形成孔隙[17]。Kim等[18]報道了一種細胞質穿透抗體TMab4，其在酸性環境下會發生構象的變化，導致內體膜孔的形成，從而實現內體逃逸。為研究其內體逃逸行為，用TMab4脈沖Hela細胞，隨后用不同內體標記物進行染色，結果表明在內吞2 h后，TMab4出現在內體中，在6 h后，逃逸到細胞質中，實現逃逸。

表1 內體逃逸劑及其機制[7, 10]

圖2 質子化效應機理示意圖[10]: 1：質子化制劑通過細胞內吞作用內化形成內小體；2：由于質子緩沖作用，伴隨氯離子的注入，質子通過ATP酶內流；3：內小體離子濃度高，可從胞漿中吸水，導致滲透膨脹；4：內小體破裂，釋放內容物Fig.2 Schematic of proton sponge mechanism[10]: 1: cell internalization of proton sponge agent via endocytosis to form endosome; 2: influx of protons by ATPase due to proton buffering action of the agent with concomitant influx of chloride ions; 3: high ionic concentration in endosome attracts water from cytosol leading to osmotic swelling; 4: rupture of endosome to release the endocytosed material

圖3 多肽在內體膜上自組裝形成膜孔[10]Fig.3 Peptides self-assemble to form pores in endosomal membrane[10]

2.4 光化學內化破壞內體膜

利用光化學作用激活進入細胞的光敏分子，產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，破壞內體膜的過程稱之為光化學內化(photochemical internalization, PCI)。光敏分子通過附著、包載等方式進入細胞，在光的照射下，釋放ROS，使內體膜氧化破裂，釋放內容物[19, 20](圖4)。Selbo等[21]將光敏劑TPCS2a(紅色熒光)與Alexa-488(綠色熒光)標記的AC133皂草素和WiDr細胞共孵育18 h后，觀察到熒光共定位于內體中。曝光1 h后，在整個胞質中均發現有彌散的熒光顯影，說明PCI誘導的皂草素成功實現逃逸。

圖4 光誘導內體逃逸示意圖[20]：1：光敏劑定位在內體膜；2：光照激發光敏劑產生活性氧(reactive oxygen species, ROS)；3：ROS破壞內膜釋放內容物Fig.4 Schematic illustration of photo induced endosomal release[20]: 1: localization of photosensitizer (PS) in endosomal membrane; 2: illumination of light exciting photosensitizer to generate reactive oxygen species (ROS); 3: disruption of endosomal membrane by ROS to release cargo in cytoplasm

2.5 免疫響應的屏蔽

仿生粒子的引入，可以達到屏蔽免疫系統響應的效果，實現免疫逃逸，同時使納米粒子具有生物特性，對特定組織、細胞具有靶向作用。Zhang等[22]從血液中分離出血小板，由于血小板外側膜為負電性，聚乳酸-羥基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)納米粒子也為負電性，利用靜電排斥理論使體系構成“right-side-out”結構，血小板上的各種蛋白得以保留并朝向外側，使得最終的體系既有納米粒子載體特性，又有血小板活性。結果表明，血小板膜覆蓋的納米粒子，能有效結合人膠原蛋白，并對孤立血管的損傷區域具有靶向作用。

3 藥物載體為實現內體逃逸的結構修飾

3.1 聚合物修飾

3.1.1 胺類聚合物

胺類聚合物如聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)、聚酰胺-胺、氯化銨及甲胺等，其結構中含有大量的胺基，能夠吸附質子，避免藥物受酸性環境影響，還能增大內體內滲透壓，使離子內流，造成膜的脹破，實現內體逃逸[23, 24]。Behr等[25]首先提出將PEI作為“質子海綿”，其緩沖能力在pH7.2～5.0，他的研究小組假設這種聚合物可以通過滲透壓失衡來破壞內體。Borchard等[26]將PEI加入到PLGA溶液，得到PLGA-PEI納米顆粒，對該納米顆粒負載DNA后其在細胞內分布及表達進行定位。用羅丹明標記DNA，6 h后DNA進入內體，隨后一段時間在Calu-3細胞內檢測到蛋白表達，表明納米顆粒逃離內體。

Jiang等[27]用富含胺的熒光碳納米粒子(FCNs)，攜帶能夠減少polo樣激素(polo-like Kinase 1,Plk1)表達的小干擾RNA(siPlk1)，制備得到帶有Plk1調節基因的碳納米粒子-基因復合物(C-siPlk1)，用于癌癥治療。研究者用熒光染料Cy5(紅色熒光)對C-siPlk1進行標記，得到C-Cy5 siPlk1；在37 ℃下將人類黑色素瘤A375細胞與Lysotracker(綠色熒光)共孵育2 h，熒光標記內體；隨后將含Lysotracker探針的A375細胞與C-Cy5 siPlk1在37 ℃下共孵育1 h。通過激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察發現，A375細胞與C-Cy5 siPlk1共孵育后，細胞能夠對C-Cy5 siPlk1持續攝取；在3～6 h內，發現Cy5的紅色熒光與Lysotracker的綠色熒光共定位，表明C-Cy5 siPlk1被內體攝?。贿M一步孵育9 h后，紅色熒光與綠色熒光逐漸分離，表明C-Cy5 siPlk1開始內體中成功逃逸，12 h后，僅有少數C-Cy5 siPlk1未從內體逃逸(圖5)。

圖5 Cy5標記的siPlk1在A375細胞中的內體逃逸，用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察12 h,紅箭頭顯示為完成逃逸的siPlk1,黃色箭頭為未逃逸的siPlk1[27]Fig.5 Cellular endosome/lysosome escape of C-Cy5 siPlk1 in A375 cells.The medium was replaced with optimen reduced serum medium and observed by CLSM for 12 h. The red arrows indicate the escaped siPlk1, while the yellow one indicates the encapsulated siPlk1 in endosome/lysosome[27]

PEI作為目前藥物遞送研究最成功的聚陽離子之一，能夠大大提高轉染效率，但其質子化作用越強，其細胞毒性也隨著增大[28, 29]。因此，研究者們通過在聚合物上引入聚乙二醇(PEG)、聚氧胺等非離子親水基團或直接添加陰離子來屏蔽陽離子電荷，或通過交聯可降解基團等，減少其對細胞膜結構的破壞作用，降低細胞毒性[30]。Guan等[31]設計合成醛基修飾的PEG，對PEI/DNA復合物的正電荷進行屏蔽化；復合物進入微酸性腫瘤區，在席夫堿鍵的pH響應下，PEG脫落，發揮PEI的高效轉染作用。研究表明，在pH 7.4條件下，PEI/DNA復合物的細胞存活率為83.2%，經過PEG屏蔽化后，細胞毒性明顯減輕。PEG屏蔽化作用在提高穩定性和實現長循環的同時，降低了PEI的細胞毒性。Wang等[32]設計具有負電荷和疏水基團的樹突狀PEG端粒大分子包封蛋白質-PEI復合物，最大限度減少聚陽離子誘導的細胞毒性，同時端粒分子屏蔽層在細胞內蛋白質傳遞過程中能夠與納米復合物分離，恢復高轉染特性。另有研究者將陰離子聚合物硫酸葡聚糖(DS)引入PEI/DNA復合物，得到粒徑200 nm、分散系數0.2的復合物微粒，隨著DS用量的增大，毒性降低[33]。

3.1.2 咪唑類聚合物

咪唑是分子結構中含有兩個間位氮原子的五元芳雜環化合物。咪唑基在pH小于6時，會被質子化[34]。由于內體的內環境pH較低，咪唑基團具有很好的質子化介導作用，促使“質子海綿效應”的發生。與胺類聚合物相比，聚組氨酸或聚咪唑類載體的轉染效率要更高，這可能與咪唑基能破壞內體膜的融合活性有關[35]。

Zhang等[36]合成了mPEG-PLA-Phis共聚物膠束，使用吖啶橙定位測定和鈣黃綠素攝取研究共聚物對內體膜的破壞作用。細胞核和內體分別用Hoechst33258(藍色)和Lyso Tracker DND-26(綠色)標記。負載阿霉素(DOX)的基于Phis的共聚物膠束被MCF-7細胞快速吸收，并在15 min后封裝于內體內。隨孵化時間增加，在細胞中橙色熒光(Lyso Tracker和DOX的重疊)增強，表明膠束在內體中聯系積累。4 h后，發現強烈的紫色熒光(DOX與Hoechst重疊)，表明DOX從內體逃逸到細胞核中。

聚(4-乙烯基咪唑)(poly(4-vinylimidazole)，P4V)分子結構中含有大量咪唑環，在酸性條件下可接受質子，具有“質子海綿效應”。Jong等[37]研究了P4V作為非病毒基因遞送載體，研究表明，P4V結合DNA在進入內體的酸性環境后會發生電荷的反轉，發生質子化作用，與PEI作用機理類似，可實現內體逃逸。

3.2 多肽的融合

部分兩性分子多肽中含有酸性氨基酸，如谷氨酸，其帶有負電荷的羧基在中性條件下破壞多肽的α-螺旋結構的穩定性，而在酸性環境中，促進親水親油的兩性螺旋結構的形成，通過與內體內膜的融合破壞內體。攜帶此種多肽序列的載體具有很強的內體逃逸能力[38]。蜂毒肽、聚精氨酸等堿性多肽能夠在酸性環境中形成α-螺旋，此類構象的轉變能夠提高多肽與膜結構的親和性。目前用于加強載體內體逃逸能力的多肽有蜂毒肽、KALA、GALA[39-41]等。

Yeom等[42]將KALA多肽與PEG綴合以防止PEI-DNA復合物自聚集，通過該配方得到穩定的PEI/KALA-PEG復合物。以PEI為參照，通過熒光素標記的寡核苷酸和C3細胞中的Cy3標記的質粒DNA，研究了PEI/KALA的內體逃逸能力，結果表明，轉染24 h后，使用PEI/KALA的一組，細胞內的熒光復合物明顯高于PEI，且熒光染色是在核內而非核外。這表明，KALA的加入明顯增強PEI的質子化介導作用，增強載體內體逃逸能力。

Yu及其研究小組[43]得到二硫鍵修飾的富含樹枝狀精氨酸的陽離子肽?；驈秃衔锟捎脽晒馊玖螩y5標記，熒光照射下顯紅色，而酸性內體可被LysoSensor Yellow/Blue DND-160染成綠色。研究表明(圖6)，與PEI相比，

圖6 Cy5標記的基因復合物在孵育2 h和4 h后內體逃逸情況：(1)Cy5通道，(2)LysoSensor Yellow/Blue DND-160通道，(3)通道合并，(4)局部視野放大[43]Fig.6 Images of endosomal disruption of gene complexes containing Cy5-labeled plasmid (red) in cells with LysoSensor Yellow/Blue DND-160 (green) after 2 and 4 h incubation: Cy5 channel (1), LysoSensorYellow/Blue DND-160 channel (2), overlay (3) and enlarged view (4)[43]

脂質-基因復合物組(RLS及RL)在轉染2 h，熒光即顯色為黃色熒光(紅色與綠色疊加)，表明進入內體環境；在轉染4 h時，PEI組出現黃色熒光斑點，表明PEI組也被內體吞噬，而此時的脂質-基因復合物組的有些熒光已經開始變為橙色或紅色，這表明紅色熒光量增加，證明更多的基因復合物逃離了內體環境，同時也表明，精氨酸多肽的逃逸效率較PEI明顯增加。

Kalina等[44]設計了pH觸發的成孔肽，他們從pH不敏感的成孔肽MelP5序列的18 432個組合文庫中進行高通量篩選，確定了兩性螺旋極性表面的5個氨基酸殘基，其在pH=7處為帶電、可溶狀態，在pH=5下與膜結合，螺旋成孔，實現了內體逃逸。

3.3 添加光化學誘導劑

采用光化學方法，使生物載體從內體通路釋放到包漿的手段，現已被廣泛研究[45]。許多光敏劑，包括TPPS4、TPPS2a、AIPcS2a和基于樹枝狀大分子的光敏劑(DP)主要定位在內體的膜表面，暴露于光下后，這些光敏劑會引起ROS的形成，短時間內破壞內體膜，而細胞內容物仍能保持完整并被遞送至細胞質中[7, 46]。

Yuan等[47]報道了具有聚集誘導發射(AIE)特征的光敏劑(PS)與胺基丙烯酸酯(AA)結合在光存在下，會產生ROS。通過共焦激光掃描電鏡評估復合物的細胞內轉運特征，用吖啶橙為指標對ROS誘導的內體損壞進行評價，研究表明，Hela細胞在沒有ROS參與下，呈紅色熒光(內體)和綠色熒光(細胞器細胞核)，而將其置于光照射下，紅色熒光顯著降低，表明內體被破壞，在細胞質中檢測到YOYO-1標記的DNA，實現了內體逃逸(圖7)。

圖7 ROS響應性納米顆粒的轉基因表達及內體逃逸過程[47]Fig.7 The transgene expression and endosomal escape of ROS-responsive nanoparticles[47]

Kun等[48]也報道了負載DOX和光誘導劑的聚合物膠束(D-LRPM)，用熒光分別標記內體和細胞核，有光照射下內體熒光強度較無光照射明顯降低，且DOX在細胞核處的熒光強度增加，結果表明，D-LRPM中光誘導劑產生的ROS能夠成功破壞內體膜，將包載物釋放至細胞質中。

在研究過程中，PCI技術僅通過光強度來進行調節，無光區域不會受到損失，進一步降低風險，是一種有效可控的逃逸方式[20]。

3.4 pH敏感材料的結合

pH敏感型材料是一類能夠響應所在環境pH值的微小變化，其分子結構和物理性能發生一定變化的新型材料。在機體病變細胞，以腫瘤細胞為例，腫瘤微環境具有低O2、pH降低、間質高壓、血管高滲透性等特點，生理狀態下，正常組織細胞外pH介于7.2～7.4，而惡性腫瘤細胞外pH介于6.5～6.9之間[49]。通過在藥物載體上引入pH敏感型材料，使其僅在靶點特定pH條件下完成藥物釋放，既實現了內體逃逸，又能使藥物在靶點處有效釋放。ZnO納米顆粒在生理條件下(pH 7.4)保持良好的穩定性，但在pH 5～6左右能夠快速分解[50]。Zhang等[51]利用這一特性，合成具有pH敏感特性的ZnO-MSNs，達到內體逃逸效果，實現藥物釋放的可控性。Ma等[52]將半乳糖、葡聚糖與視黃醛進行綴合，得到GDR綴合物，分別研究了pH為5.0，6.5和7的PBS緩沖液中GDR納米凝膠的流體動力學尺寸。研究表明，其在pH=7.4下，粒徑保持不變；在pH=6.5下，粒徑有所增加；在pH=5.0時，粒徑增大為中性條件下的3倍，具有明顯的pH敏感效應。通過熒光標記示蹤可知，孵育6 h后，包載疫苗的GDR與內體共定位，并觀察到有超過50%的內含物從內體中解離出來，實現內體逃逸。研究推測，腙鍵的裂解消耗大量質子，從而增加了質子、氯離子和水的流入，從而引起內體溶脹和損傷。

3.5 脂質材料

二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)及其衍生物在環境中會發生相變，繼而破壞內體膜，相關研究表明，磷脂酰乙醇胺連接不同種類的不飽和脂肪烴鏈在生理條件下為負電性，復合物表現為層狀，在pH下降時，PE質子化使得復合物變為六角形[53]。六角形的復合物對膜具有較大的破壞性，能完成內體逃逸。Safinya課題組[54]使用小角度X射線散射加速器將二油酰三甲基銨丙烷(DOTAP)-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)的結構與其轉染效率相關聯，DOPE被發現可以誘導DNA-脂質復合物從多層結構向個倒六角液晶相的轉變。反向六邊形結構能夠促進與陰離子膜之間的相互作用，導致膜融合和DNA釋放。

4 結 語

近年來，一系列具有良好的生物相容性、組織滲透性、高靶向性、無毒、易吸收的納米載體得到了廣泛的開發和應用，但內體屏障的存在也限制了納米藥物的發展。目前，通過膜融合或形成膜孔的形式實現內體逃逸的多肽、蛋白類材料逃逸效率高但具有一定免疫原性；而聚合物類逃逸材料在胞內仍存在一定毒性；利用仿生粒子實現免疫逃逸，一定程度避免免疫原性，又無細胞毒性，但其不具有普遍作用性，仍難以得到實際應用。

在現有載體材料基礎上，通過對內體逃逸機制的進一步了解，將會推動藥物載體的發展和應用。相信隨著對藥物載體在胞內的轉運、代謝及內體免疫等機理的進一步揭示及新型藥物載體的開發，內體逃逸劑將會有更為廣闊的發展空間。