4種固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片固定效果的比較

童康梅 郭國(guó)棟 黃海建 陳小巖

甲狀腺疾病是臨床中的常見病和多發(fā)病，治療主要采用手術(shù)切除。一般均要求進(jìn)行術(shù)中快速冷凍病理診斷，以確定腫瘤性質(zhì)，有利于決定手術(shù)方式和手術(shù)范圍，也可使患者免受二次手術(shù)的痛苦[1-3]。快速病理診斷要求時(shí)間短、診斷準(zhǔn)確，冷凍切片是術(shù)中快速病理診斷的主要方法，冷凍切片技術(shù)在病理診斷中具有舉足輕重的作用[4-6]，冷凍切片的質(zhì)量將影響病理診斷的快速性和診斷性。甲狀腺組織結(jié)構(gòu)特殊，而影響甲狀腺冷凍切片質(zhì)量的因素眾多，如取材，冷凍時(shí)間與溫度，固定液，切片技術(shù)等，其中固定液的選擇至關(guān)重要。下面選取4種不同的固定液來進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，通過HE染色觀察4種固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片的固定效果，從而篩選出一種甲狀腺冷凍切片的最佳固定液。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

福建省立醫(yī)院南院病理科2017年5月—2018年5月新鮮甲狀腺手術(shù)切除標(biāo)本30例。

1.2 儀器及試劑

徠卡CM1950-1冷凍切片機(jī)，包埋劑OCT，Thermo MX35型一次性刀片，蘇木精染液，1%鹽酸乙醇分化液，0.5%氨水返藍(lán)液，1%醇溶性伊紅，各濃度梯度乙醇，二甲苯，中性樹膠。

1.3 固定液

（1）95%乙醇；（2）10%中性緩沖福爾馬林固定液；（3）AF液：95%乙醇90 mL，甲醛10 mL混合固定液；（4）AFA液：95%乙醇85 mL，甲醛10 mL，冰醋酸5 mL混合固定液。

1.4 方法

將徠卡CM1950-1冷凍切片機(jī)箱體溫度設(shè)置為-18℃，冷凍切片機(jī)機(jī)頭溫度設(shè)置為-15℃，切片厚度6 μm，提前開啟PE速凍臺(tái)。送檢新鮮甲狀腺標(biāo)本，規(guī)范取材，用濾紙將組織表面的血性液體吸干，然后將組織放入提前制備的OCT冰托上，再加蓋少量包埋劑，用冷凍錘輕輕壓平。粗修暴露最大面，然后6 μm厚連續(xù)切片4張，平整地吸附于潔凈的載玻片上，分別迅速放入已準(zhǔn)備好的4種固定液中固定1 min，稍水洗，入蘇木素染色1 min，水洗；1%鹽酸乙醇分化2 s，稍水洗；0.5%氨水返藍(lán)，稍水洗；75%乙醇10 s，醇溶性伊紅10 s，梯度乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

經(jīng)10%中性福爾馬林固定的冷凍切片，組織結(jié)構(gòu)模糊，核質(zhì)對(duì)比度差，核固縮，核染色模糊，大部分膠質(zhì)脫落（如圖①、圖⑤）。經(jīng)95%乙醇固定的冷凍切片染色效果一般。組織結(jié)構(gòu)尚清晰，核質(zhì)對(duì)比度一般，胞核染色不佳，核明顯收縮，濾泡膠質(zhì)部分著色，部分膠質(zhì)濾泡缺失（如圖②、圖⑥）。經(jīng)AF液固定的冷凍切片，組織結(jié)構(gòu)較清晰，核質(zhì)對(duì)比度一般，核輕微收縮，膠質(zhì)濾泡幾乎全部著色（如圖③、圖⑦）。經(jīng)AFA液固定的冷凍切片染色效果最好。組織結(jié)構(gòu)清晰，顏色鮮艷，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡粉色，細(xì)胞形態(tài)清晰，核質(zhì)對(duì)比度良好，濾泡膠質(zhì)全部著色，鏡下最接近石蠟切片HE染色（如圖④、圖⑧）。具體詳見圖1。4種固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片固定效果的比較，詳見表1。

表1 4種固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片固定效果的比較

圖1 4種固定液對(duì)甲狀腺冷凍切片效果的顯微攝影比較

3 討論

固定液具有滲透、殺死細(xì)胞及其微生物和固化組織等作用，是保存組織器官用于病理診斷所必需的過程；固定液保持離體組織細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài)相似，抑制組織自溶及細(xì)菌繁殖所致的腐爛；使細(xì)胞內(nèi)一些蛋白質(zhì)等可沉淀或凝固，使其定位在細(xì)胞內(nèi)的原有部位，有利于固定后物質(zhì)的確切定位；保持細(xì)胞內(nèi)組織抗原、DNA、RNA，便于進(jìn)一步的特殊檢查；有利于染色反應(yīng)，便于光鏡下對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同成分進(jìn)行區(qū)別[7]。甲狀腺實(shí)質(zhì)由大量甲狀腺濾泡和濾泡旁細(xì)胞組成，濾泡間有少量結(jié)締組織和豐富的毛細(xì)血管；甲狀腺濾泡腔內(nèi)充滿透明的膠質(zhì)，膠質(zhì)是濾泡上皮細(xì)胞的分泌物，即碘化的甲狀腺球蛋白，在切片上呈均質(zhì)狀，嗜酸性；膠質(zhì)邊緣常見空泡，是濾泡上皮細(xì)胞吞飲膠質(zhì)所致。由于大多數(shù)甲狀腺病變形態(tài)表現(xiàn)為濾泡結(jié)構(gòu)，如甲狀腺腫、甲狀腺炎、腺瘤及甲狀腺癌等，認(rèn)識(shí)各種濾泡性病變，不僅有助于做出正確的病理診斷，而且能有機(jī)的與甲狀腺功能相聯(lián)系，全面解釋患者的臨床癥狀和體征，而選擇最佳的固定液就能最大限度地縮小冷凍切片與常規(guī)石蠟切片的差異性[8-9]。甲狀腺結(jié)構(gòu)的特殊性決定了甲狀腺在冷凍切片中對(duì)固定液選擇和染色過程中條件選擇的特殊性[10]。

甲醛為非沉淀性固定劑，不能使白蛋白和核蛋白沉淀，通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用[11]。甲醛水溶液滲透能力強(qiáng)，固定均勻，對(duì)組織收縮較少，10%中性福爾馬林緩沖液可以很好的保存細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也能夠較好地保存組織細(xì)胞的大多數(shù)抗原性，是一種最理想的常規(guī)固定液。但用10%中性福爾馬林緩沖液固定冷凍切片時(shí)間長(zhǎng)，需固定10 min以上[12]，由于甲狀腺結(jié)構(gòu)的特殊性，用10%中性福爾馬林緩沖液僅短時(shí)間固定后，組織結(jié)構(gòu)模糊，核質(zhì)對(duì)比度差，核固縮，核染色模糊，膠質(zhì)脫落現(xiàn)象明顯，固不適合用于快速冰凍切片固定。

95%乙醇用于固定，對(duì)纖維蛋白和彈性纖維等固定效果好，其滲透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋白經(jīng)沉淀后，能溶于水，不利于染色體的固定[11]，因此單純用乙醇固定的組織其細(xì)胞核染色不佳，細(xì)胞收縮明顯，且有膠質(zhì)脫落現(xiàn)象，不適合單獨(dú)用于快速冰凍切片的固定。

冰醋酸的穿透能力強(qiáng)，不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白，可較好地保存染色體的結(jié)構(gòu)，能清楚地顯示細(xì)胞核，缺點(diǎn)是組織膨脹較明顯，尤其對(duì)膠原纖維和纖維蛋白，一般很少單獨(dú)使用[12]。

AF液由95%乙醇，濃甲醛混合配制而成，甲醛固定作用均勻，組織收縮小，但不能沉淀核蛋白，與乙醇混合使用可兼有固定和脫水的作用，細(xì)胞核收縮略小，性能略優(yōu)，但不是最佳。

AFA液由95%乙醇，濃甲醛、冰醋酸混合配制而成，不僅穿透力強(qiáng)，能迅速沉淀蛋白質(zhì)，還能使細(xì)胞染色更清晰。此液中甲醛與乙醇混合兼有固定和脫水的作用，加冰醋酸后促使固定加快，穿透力強(qiáng)[7]，膨脹性強(qiáng)，可以緩沖乙醇的收縮作用，且冰醋酸能增強(qiáng)核染色的選擇性，使核漿顏色對(duì)比鮮明，加入冰醋酸不僅抵消了乙醇收縮的缺點(diǎn)，使細(xì)胞核漿染色更清晰，且冰醋酸還可以有效地防止膠質(zhì)脫落現(xiàn)象的發(fā)生[7]，濾泡膠質(zhì)幾乎全部著色。

綜上所述，AFA液固定的甲狀腺冷凍切片，固定效果好，鏡下最接近石蠟切片HE染色，有助于提高診斷的準(zhǔn)確性，所以認(rèn)為AFA液是以上四種固定液中甲狀腺組織快速冰凍切片的最佳固定液之一。