交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在EHEC檢測中的應(yīng)用

劉文鑫 袁超文 馮瑜菲

腸出血性大腸桿菌O157：H7是一種比較常見的血清型菌株，其會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)出血性結(jié)腸炎或者是溶血性尿毒綜合癥等一系列對患者的身體健康造成嚴(yán)重傷害的疾病[1]。在感染O157：H7之后，疾病的發(fā)展速度比較快，患者的病情如果再短期內(nèi)無法得到控制極有可能死亡，在世界各國都曾有因O157：H7感染暴發(fā)所導(dǎo)致的大范圍死亡情況出現(xiàn)，這種感染對公眾的生命健康造成了極其嚴(yán)重的威脅，引起世界衛(wèi)生部門的廣泛關(guān)注。因此，必須要建立起兼?zhèn)涮禺愋浴㈧`敏度與快速性的檢測方法，對O157：H7進(jìn)行快速檢測[2]。在現(xiàn)階段，我國仍然沿用傳統(tǒng)的GB/T4789.4-2010作為對O157：H7進(jìn)行檢測的依據(jù)，其在實(shí)踐中已經(jīng)暴露出了越來越多的缺點(diǎn)，采用這種方法來進(jìn)行檢測消耗的時(shí)間比較長，檢出率也比較低，不能做到快速檢測。ELISA和PCR等檢測方法也可以對O157：H7進(jìn)行檢測，且檢測的速度比較快，但是，需要注意的是，采用這些檢測方法時(shí)仍然存在缺陷，或是特異性不夠高，或是靈敏度比較低，操作起來比較困難，在檢測實(shí)踐中不易上手，對檢測人員、場地和設(shè)備的要求相對來說都比較高，不能適應(yīng)出入境口岸的檢測速度要求[3-4]。交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（CPA）是近年來研究出的一種新型檢測技術(shù)，其反應(yīng)系統(tǒng)由交叉引物、玻璃引物和監(jiān)測探針組成，主要由BstDNA聚合酶及MgSO4等具備DNA鏈置換功能的成分構(gòu)成，通過基于膠體金免疫層析技術(shù)的核酸試紙條，這些反應(yīng)成分的擴(kuò)增產(chǎn)物可以展開特異性檢測[5]。交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增溫度一直保持同一個(gè)數(shù)據(jù)，在進(jìn)行檢測的過程中，所需要使用的操作設(shè)備為普通的加熱器，檢測在密閉環(huán)境中進(jìn)行，肉眼可見檢測結(jié)果，所以對反應(yīng)條件和技術(shù)人員檢測技術(shù)的要求也相對較低，完全避免了交叉污染所造成的假陽性反應(yīng)出現(xiàn)[6]。在此次研究當(dāng)中，對應(yīng)用交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來進(jìn)行腸出血性大腸桿菌O157：H7的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確性以及檢測所耗時(shí)間進(jìn)行了分析，以期對在實(shí)踐中應(yīng)用此種檢測方法的實(shí)用性進(jìn)行探究。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品與菌株

食品檢測樣品。在此研究當(dāng)中所使用的食品檢測樣品共70例。

菌株。研究中所用的腸出血性大腸桿菌O157：H7共計(jì)三株，包括標(biāo)準(zhǔn)株和地方株。除此之外的13株分別是腸產(chǎn)毒型大腸埃希菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門菌、副溶血弧菌、幽門螺桿菌、空腸彎菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、假絲酵母菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、化膿性鏈球菌。金黃色葡萄球菌、結(jié)核分桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌購自廣東省微生物研究所，其他菌株從中國藥品和生物制品鑒定研究院買入。

1.2 儀器

在此次研究當(dāng)中使用的設(shè)備分別是：購自于BioRad公司的熒光定量PCR儀以及購自于生物梅里埃公司的全自動(dòng)微生物鑒定儀。

1.3 試劑及培養(yǎng)基

此次研究當(dāng)中所使用的試劑盒分別是：購自北京百奧萊博的O157：H7實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、購自于上海拜諾生物科技公司的DNA快速提取試劑盒以及大腸桿菌O157：H7檢測試劑盒。

此次研究當(dāng)中所使用的培養(yǎng)基分別是：購自于廣東環(huán)凱生物科技公司的普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂平板、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基以及購自于寧波天潤公司的腸出血性大腸桿菌O157：H7診斷血清。

1.4 方法

1.4.1 模擬食品樣本及菌株DNA模板的制備 首先需要將本次研究所需要的16種菌株在普通平板或者是血平板上進(jìn)行接種，培養(yǎng)溫度保持在37℃，培養(yǎng)時(shí)長則應(yīng)該控制在18～24 h，選取單個(gè)菌落提取細(xì)菌DNA，在提取過程當(dāng)中應(yīng)該嚴(yán)格按照試劑盒上的操作說明來進(jìn)行提取。

模擬實(shí)物樣本則需要在實(shí)驗(yàn)購入的普通營養(yǎng)肉湯當(dāng)中進(jìn)行增菌，培養(yǎng)溫度保持在37℃，培養(yǎng)時(shí)長則應(yīng)該控制24 h左右，在吸取增菌液之后采用試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA提取工作。

1.4.2 CPA引物與探針的設(shè)計(jì) 在此次研究中CPA引物與探針需要根據(jù)O157：H7的基因特征保守型序列進(jìn)行設(shè)計(jì)[7-8]。其中，擴(kuò)增產(chǎn)物以及各引物、探針的序列為：

C A G T C G T A C C G G G A T C C A G A T A A A T C G CC A T T C C T T G A C T A C T T C T T A T C T G G A T TT A A T G T C C C A T A G T G G A A C C T C A C T G A C GC A G T C T G T G G C A A G A G C G A T C T T A C GG T T T G T T A C T G T G A C A G C T G A A C C T TT A C C T T T T C G G C A A A T A C A G A G G GG A T T T C G T A C A A C A C T G G A T G A T C T C A G TGGCCGTTCTTATGTAATGACTCCTGA

剝離引物的序列為：

EHECVT1F3：5-CAGTCCTACGGGGATCCAG

EHECVTIB3：5-TCACCAGTCATTACATAAG

交叉引物的序列為：

E H E C V T I C P F 2：5-G C T C T T G C C A C A G A C TGCGTCAGTTTCGCCATTCGTTGACTACTT

檢測探針的序列為：

EHECVTIDR5B：5BIOTIN-CCTCTTCCCA-CAGACTCCCTC

EHECVT1DR5F：5FTTC-AGGTTCCCCTAT-CCGACAT

1.4.3 CPA擴(kuò)增反應(yīng)及檢測體系 在PCR反應(yīng)管當(dāng)中加入擴(kuò)增反應(yīng)試劑、ddH20和制備完成的DNA模板，劑量分別為：10 μL、6 μL和4 μL，總體積保持三項(xiàng)試劑相加數(shù)量不變，將其在反應(yīng)管當(dāng)中擴(kuò)增1 h，溫度控制為63℃。擴(kuò)增完成之后將之放入檢測裝置，在檢測中質(zhì)控線和檢測線都出現(xiàn)顯色條帶，假設(shè)顯色深于比色卡條帶顏色，則可以判定為陽性，若否之，則為陰性。

1.4.4 模擬食品樣本中EHECO157：H7的檢測 對采用CPA法進(jìn)行檢測過的EHECO157：H7為陰性的牛肉加入到磷酸鹽緩沖液制成勻漿，牛肉數(shù)量為20 g，磷酸鹽緩沖液劑量為80 mL，制作完成之后取1 mL接種EHECO157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株（濃度已知），在混勻之后將其作為模擬食品樣本的原樣，模擬70份含此菌株以及不含此菌株的樣品，采用分離培養(yǎng)鑒定法、CPA法以及熒光定量PCR法等三種檢測方法來進(jìn)行檢測。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 CPA-EHECO157：H7檢測體系的特異性 取本次研究所選取的全部16株菌株在按照上述方法制備DNA模板之后進(jìn)行擴(kuò)增檢測，對其特異性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5.2 CPA-EHECO157：H7檢測體系的敏感性 選取經(jīng)過增菌培養(yǎng)之后的EHECO157：H7標(biāo)準(zhǔn)株的菌液，劑量選擇為1 mL，采生理鹽水按照10倍的比例來進(jìn)行稀釋工作，在LB平板上涂抹不同稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)物，溫度保持在37℃的情況下培養(yǎng)8～10 h，培養(yǎng)時(shí)間為夜間，對每毫升培養(yǎng)物當(dāng)中的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，與此同時(shí)，需要取以上各個(gè)濃度的稀釋液制備各自的模板，并對其進(jìn)行CPA以及熒光定量PCR檢測，對檢出濃度為各模板中最低的樣本反復(fù)進(jìn)行測定，最少測定次數(shù)為10次，若95%以上測定該樣本為陽性，則可以確定最低檢測值就是該濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

在此次研究當(dāng)中的資料均使用SPSS 17.0來進(jìn)行檢測，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 CPA檢測體系的特異性

所抽選的菌株當(dāng)中只有3株EHECO157：H7菌株是呈陽性的，其余菌株的檢測結(jié)果皆為陰性。

2.2 CPA檢測體系的敏感性

標(biāo)準(zhǔn)株用瓊脂平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法10倍梯度稀釋，取理論濃度為107、106、105、104、103、102、101cfu/mL的樣本，標(biāo)記N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7，用CPA進(jìn)行檢測。結(jié)果為：N1～N6為陽性，N7陰性。

取最高稀釋度為樣本檢測10次，陽性率達(dá)到100%，所以最低檢出限為102cfu/mL。

2.3 模擬樣本檢測結(jié)果

采用熒光定量PCR以及CPA檢測的結(jié)果，如表1所示。

由表1當(dāng)中的數(shù)據(jù)可以計(jì)算出，以熒光定量為參考，CPA法的靈敏度為97.14%（34/35），特異性為91.42%，準(zhǔn)確率為94.28%。

一致性：χ2=0.14，根據(jù)卡方界值表P＞0.05，證明兩種檢測方法的檢測結(jié)果無差異性。

采用分離培養(yǎng)法以及CPA檢測的結(jié)果如表2所示。

表1 熒光定量PCR以及CPA檢測的結(jié)果（n）

表2 分離培養(yǎng)法以及CPA檢測的結(jié)果（n）

由表2當(dāng)中的數(shù)據(jù)可以計(jì)算出，靈敏度為97.22%（35/36），特異性為94.11%（32/34），準(zhǔn)確率為97.14%（68/70）。

一致性：χ2=0.04，根據(jù)卡方界值表P＞0.05，證明兩種檢測方法的檢測結(jié)果無差異性。

3 討論

根據(jù)臨床醫(yī)學(xué)研究，腸出血性大腸桿菌O157：H7感染的致死率比較高，由這種感染所造成的食源性疾病已經(jīng)造成了世界范圍內(nèi)的大問題，對食品安全造成極其不利的影響。因此，學(xué)界必須認(rèn)識(shí)到對腸出血性大腸桿菌O157：H7所采用的檢測方法的特異、靈敏以及快速的重要性，從而在實(shí)踐中進(jìn)行深入研究[9]。在現(xiàn)階段，我國仍然沿用傳統(tǒng)的GB/T4789.4-2010作為對腸出血性大腸桿菌O157：H7進(jìn)行檢測的依據(jù)，檢測中的特異性相對來說比較低，靈敏度也比較差，檢測所需要消耗的時(shí)間比較長，實(shí)用性極差。而熒光定量PCR等其他檢測技術(shù)雖然相對來說檢測速度比較快、各項(xiàng)特性都比較強(qiáng)，但是在進(jìn)行檢測的過程中對檢測環(huán)境、設(shè)備和操作技術(shù)等都有著比較高的要求，實(shí)用性比較差，不適合投入到實(shí)踐的檢測工作當(dāng)中[10]。

交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種近幾年來發(fā)展出的新技術(shù)，這種技術(shù)要在恒溫環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，檢測速度比較快，特異性比較高，且對檢測設(shè)備和檢測技術(shù)的要求都比較低，非常適宜投入到大范圍的適用當(dāng)中[11]。交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在反應(yīng)原理、反應(yīng)系統(tǒng)、檢測等方面都較傳統(tǒng)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行了創(chuàng)新與完善，DNA聚合酶作用于交叉引物和剝離引物，從而使多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)在同一模板上進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)繁盛之后，許多單鏈DNA被置換出來，這些DNA可以繼續(xù)參與到核酸擴(kuò)增反應(yīng)當(dāng)中，同時(shí)也可同檢測探針發(fā)生雜交反應(yīng)，從而通過核酸試紙條完成特異性檢測。

交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，有著獨(dú)特的優(yōu)越性：首先，這種技術(shù)相對來說完成反應(yīng)所消耗的時(shí)間比較少，可以在比較短的時(shí)間內(nèi)完成反應(yīng)，對一些比較常見的病毒細(xì)菌DNA進(jìn)行檢測的過程中，其核酸擴(kuò)增反應(yīng)的完成之間大多控制在1 h左右；其次，這種技術(shù)操作起來比較簡單，對反應(yīng)條件的要求比較低，操作步驟比較簡單，容易上手，對操作人員的技術(shù)要求比較低，適宜在大范圍內(nèi)進(jìn)行普及；最后，這種技術(shù)在進(jìn)行腸出血性大腸桿菌O157：H7檢測時(shí)，需要的儀器相對其他檢測方法來說也極其簡單，普通的加熱器就達(dá)到了檢測標(biāo)準(zhǔn)要求[12]。

此次研究發(fā)現(xiàn)，采用交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來進(jìn)行檢測時(shí)，只有大腸桿菌O157：H7菌株的結(jié)果呈陽性，其他13株菌株均為陰性；其敏感度、特異性以及準(zhǔn)確率都要優(yōu)于其他檢測方法，檢出的速度相對來說也比較快。

綜上所述，采用交叉引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來進(jìn)行腸出血性大腸桿菌O157：H7檢測，對操作環(huán)境和操作人員的技術(shù)水平要求比較低，操作步驟簡單易上手，檢測特異性和靈敏度都比較強(qiáng)，因此檢測的結(jié)果也更加準(zhǔn)確，檢測速度比較快，適用于我國出入境口岸的檢測以及各種食物檢測，較現(xiàn)階段其他腸出血性大腸桿菌O157：H7檢測方法有著不可超越的優(yōu)越性。