基于反射光譜特征的肝組織熱損傷動態分析*

趙金哲,王娟,晉曉飛,錢志余△,李韙韜，劉珈

(1.南京航空航天大學 自動化學院 生物醫學工程系，南京 211106； 2.湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，長沙 410013)

1 引 言

微波消融和射頻消融作為兩種主要的介入式微創熱消融手段，已經成為早期肝癌的常用治療方式[1]。肝癌消融治療中，術中消融邊界監控是實時評估消融療效的主要方法之一[2]。由于生物組織熱損傷取決于溫度和時間兩方面的因素，而目前以溫度為主要參數的術中監測方法，無法從熱損傷本質上反映出組織毀損程度，其評價指標往往依靠醫生的經驗來確定[3]。因此，尋找一種更加準確、靈敏的術中療效評估手段是熱消融治療研究的重要方向之一。

近紅外光譜技術是利用人體組織內不同物質在近紅外波段吸收、散射等特性的差異來分析組織成分和功能的常用手段，具有簡便、實時、無創或微創等技術優勢[4]。應用近紅外光譜技術進行消融損傷分析為消融手術實時療效評估提供了一種便捷的解決方案。許多研究者針對肝組織熱損傷前后的光譜變化進行了分析。Ritz等[5]對比了新鮮和消融凝固肝組織在400～2400 nm波段的吸收、散射特性差異；Lin等[6]和Buttermere等[7]分析了消融過程肝組織熒光光譜和反射光譜的變化，并采用特征峰值來反映組織熱損傷進展；Yoshimura等[8]將反射光譜強度與熱損傷動態過程相聯系并分析了肝組織的熱損傷參數；戴麗娟等[9]采用830～900 nm波段的反射光譜斜率來表征肝組織熱損傷程度。前期研究中，我們也驗證了以光譜分析方法推導得到的約化散射系數(Reduced Scattering Coefficient)來評估肝組織消融損傷程度的可行性，并以之測定了肝組織熱損傷參數[10-11]。

上述研究表明，熱損傷使肝組織產生的宏觀光學特性改變較為明顯，反射光譜強度或以之推導得到的評估參數與熱損傷程度有密切關聯。然而，以光譜分析方法來衡量不同物質的變性程度或識別損傷產物則更利于消融療效評價。針對該問題，Spliethoff等[12]和Tanis等[13]采集了熱損傷前后血液和肝腫瘤的近紅外光譜，以光譜形狀變化識別高鐵血紅蛋白(Methemoglobin)的產生，并以光譜導數特征峰的比值評價熱損傷。但是，這種分析方式容易受到光譜斜率變化的影響，其評估參數對血紅蛋白變性的動態過程表征不夠連續。因此，如何在采用簡便測量方法的同時動態分析組織主要物質的熱損傷過程仍有待研究。

在現有研究基礎上，我們采用近紅外光譜技術分析肝組織熱損傷過程中不同波長下反射光強的變化速率，并討論了其在不同溫度下的動態差異與組織血紅蛋白熱損傷進程的關聯，以驗證將其用于消融熱損傷進程評估的可行性。

2 材料與方法

2.1 實驗材料及實驗系統組成

實驗材料為當日獲取的新鮮離體豬肝，均勻選取無較大血管的部分切成長約5 cm的條狀并置于無菌試管中。實驗采用恒溫水浴方式對肝組織進行熱致損處理，恒溫水浴溫度分別設置為60 ℃、70 ℃和80 ℃，每組實驗重復1次以驗證結果，共進行6次實驗。為了保證實驗結果的一致性，各組實驗采用的樣本均來自同一豬肝。

實驗采用的光譜采集系統主要包含光纖光譜儀(USB2000，海洋光學，美國)、鹵素光源(HL-2000，海洋光學，美國)和雙光纖探頭，其中雙光纖探頭由相同的兩根單模光纖組成，芯徑均為200 μm，中心間距為200 μm。溫度監測采用自制測溫探針，探針頂端內置熱敏電阻(芝浦，日本)，測溫針連接至單片機進行數據采集，經標準鉑電阻校準后測溫精度為±0.5 ℃。

實驗系統組成見圖1。實驗前，將雙光纖探頭和測溫針緊密并列，經試管橡皮塞插入豬肝中約7 cm并固定。將試管置入設定好溫度的水浴鍋中開始加熱，同時開始記錄光譜與溫度數據變化。不同恒溫水浴中保持時間分別為：60 ℃下加熱10 min，70 ℃下加熱8 min，80 ℃下加熱6 min。達到時間后停止數據采集并取出試管。

圖1 實驗系統組成

2.2 數據采集與處理

光譜和溫度采樣頻率為1 Hz，由計算機實時記錄數據并處理。實驗開始前，先采集光學白板的反射光譜作為參考光譜，記為R0(λ)，之后開始實驗并保持光譜儀積分時間不變。參考光譜R0(λ)和實驗采集的原始光譜Rraw(λ)采用低通濾波器去噪后，將Rraw(λ)與R0(λ)相除，以補償鹵素光源不同波長光強的差異：

(1)

為了分析不同波長λi處的反射光強在熱損傷過程中動態變化速率的差異，將不同時刻t的R(t, λi)對所有加熱時間歸一化：

(2)

其中，NR(t, λi)為t時刻λi處歸一化反射光強，min(R(λi))和max(R(λi))分別為熱損傷過程R(λi)的最小值和最大值。因此，t時刻的歸一化反射光譜為NR(λ)。由于不同波長處的反射光強與組織不同物質在該波長處的吸收和散射特性有關，其在熱損傷過程的損傷程度與速率可能并不一致。因此，進一步將NR(λ)對波長求差分，可以分析各時刻不同波長反射光強的差異：

(3)

根據NR和ΔNR的變化,可以觀察損傷過程中組織不同波段反射光譜的動態變化特性。同時，將NR與ΔNR變化速率出現差異的波長與不同血紅蛋白的吸收峰值[14](圖2)比較，可以進一步分析其與血紅蛋白熱損傷變性的關聯。

3 結果與討論

3.1 反射光譜變化

實驗中組織反射光譜R的變化見圖3，隨著熱損傷的產生，光譜強度逐漸增加。其中520～600 nm左右的波谷主要對應為血紅蛋白的吸收。在所設定的三個加熱溫度下，加熱結束時反射光譜的最大強度隨溫度增大，略有增加，不同波段光譜強度相對變化并不一致。

圖2 含氧血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的特征吸收譜

Fig2Characteristicabsorbancespectraofoxyhemoglobinanddeoxyhemoglobin

圖3肝組織熱損傷過程的反射光譜變化

Fig3Liverreflectancespectrumchangesduringthermaldamageprogress

3.2 反射光譜變化速率與熱損傷動態分析

熱損傷過程的歸一化反射光譜NR見圖4(a)，不同溫度實驗組中光譜變化速率不同。隨著溫度升高，光譜變化速率顯著增加。60 ℃下NR在加熱結束時達到最大強度，而70 ℃和80 ℃組短波段NR在達到最大值后略有下降，這可能是高溫作用下吸光色團的進一步變性。各組實驗中，同一時刻的NR曲面并不光滑，說明不同波長處的NR變化程度并不一致，這可以從光譜差分ΔNR的變化中明顯觀察到(見圖4(b))。同組實驗中，隨著溫度升高，ΔNR出現了明顯的峰值變化，即不同波長下NR的變化速率開始出現差別。在70 ℃和80 ℃組中這一差別更加明顯，且由于最高加熱溫度和升溫速率的不同，ΔNR變化速率也不相同，80 ℃組中峰值變化更迅速。

這一結果可以由肝組織不同物質受熱損傷速率的差異來說明。對某一波長處的反射光譜R(λ)來說，其強度取決于肝組織各種物質吸收和散射特性的疊加，當某一物質發生變性時，R(λ)也會隨之改變。進一步，NR(λ)表達了整個熱損傷過程中這一波長下反射光強的變化進程，其變化速率也決定于不同物質受熱變性的速率的疊加。而對于具有不同光學特性的物質來說，以含氧血紅蛋白(oxyhemoglobin, oxyHb)和脫氧血紅蛋白(deoxyhemoglobin, deoxyHb)為例，若t時刻其對NR(λ)的影響分數分別表示為ωoxyHb(λ)和ωdeoxyHb(λ)，剩余濃度分別為CoxyHb(t)和CdeoxyHb(t)，則可以將NR(t,λ)寫為：

NR(t,λ)=ωoxyHB(λ)·CoxyHB(t)+ωdeoxyHB(λ)·CdeoxyHB(t)

(4)

波長λ1和λ2處變化速率分別為:

(5)

圖4 熱損傷過程歸一化反射光譜及光譜差分隨時間的變化

(6)

因為NR對各個波長進行了歸一化，對于不同波長λ1和λ2有:

ωoxyHB(λ1)+ωdeoxyHB(λ1)=ωoxyHB(λ2)+ωdeoxyHB(λ2)

(7)

因此，當oxyHb和deoxyHb的受熱變性速率不一致，即dCoxyHb(t)/dt和dCdeoxyHb(t)/dt不相等時，dNR(t,λ1)/dt與dNR(t,λ1)/dt也不相等。若在某一波長處ωoxyHb(λ)顯著大于ωdeoxyHb(λ)，則NR變化速率主要由oxyHb的熱變性速率決定，反之亦然。

由式(4)至式(7)的分析可以看出，NR的變化反映了肝組織主要吸收色團(oxyHb和deoxyHb等)的變性速率差異和變性程度。為了分析各組實驗中NR變化速率的差異與肝組織不同血紅蛋白峰值的對應關系，將NR變化的等高線圖與ΔNR峰值所在波長對應的變化曲線進行對照，見圖5。從NR等高線圖中可以看出，三組實驗中，60 ℃組和70 ℃、80 ℃兩組變化速率差別較大。與圖2中oxyHb和deoxyHb的特征吸收峰對照可以發現，70 ℃組中578 nm、543 nm和80 ℃組中579 nm、536 nm的速率差對應oxyHb的吸收峰，556 nm處的速率差對應deoxyHb的吸收峰。而60 ℃組未達到oxyHb和deoxyHb發生明顯熱損傷變性的溫度范圍[15-16]，紅細胞形態、肝組織細胞結構等變化間接引起oxyHb和deoxyHb對NR的影響，可能是該實驗組569 nm 附近產生速率差的主要原因。此外，由于溫度過高時高鐵血紅蛋白(methemoglobin, metHb)的產生，70 ℃和80 ℃組中621 nm和780 nm處的速率差可能由于metHb和deoxyHb吸收強度的相對變化引起[13, 17]。

不同溫度下ΔNR隨時間改變的曲線更加明顯地反映了NR變化速率的差異。圖4(b)中ΔNR的波峰、波谷所在波長值及該波長下的ΔNR變化見圖5。三組實驗中，70 ℃組和80 ℃組中ΔNR波峰和波谷所在的波長值相同，而60 ℃組則與之有所差別。60 ℃組中，隨著溫度升高，594 nm處ΔNR變化明顯，其余各波長變化較小。70 ℃和80 ℃組中各波長ΔNR均呈先增后減的變化趨勢，且80 ℃組由于溫升速率較大，這種趨勢隨時間變化更加迅速。由于ΔNR變化與組織物質發生熱損傷反應相關聯，ΔNR明顯變化的范圍即反映了熱損傷迅速進行的范圍。當ΔNR達到最大值時，損傷反應速率達到最大值；當ΔNR減小并接近0時，該溫度下損傷反應接近飽和。因此，通過ΔNR各峰值曲線的位置和變化速率能夠準確判斷熱損傷進行的程度與變化趨勢，并可以具體觀察oxyHb和deoxyHb的熱變性過程，從而避免了難以從反射光譜中直接辨別不同物質變性程度的缺點。

圖5歸一化反射光譜變化的等高線圖及其差分特征峰隨時間和溫度的變化曲線

Fig5Contourofnormalizedreflectancespectrumandchangesofpeakvaluesofspectrumdifferentialovertimeandtemperature

4 結論

本研究采用近紅外光譜技術，分析了不同溫度下肝組織熱損傷過程的反射光譜動態變化特征，并將這些動態變化特征與肝組織在可見-近紅外波段的主要吸光物質，如oxyHb、deoxyHb的吸收光譜特征和熱變性過程聯系起來，從而以反射光譜動態變化速率上的差異來評估肝組織的熱損傷程度。本研究采用的分析方法有助于利用近紅外光譜技術區分組織不同物質的熱損傷進程，并應用于消融治療中消融邊界的監測和消融療效評估，從而提高消融手術的成功率。