亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與大劑量甲氨蝶呤不良反應的相關性研究

何 霞，姚平立，吳 宇，侯正堯，李星星，張 遠，串俊蘭，鐘 磊，肖洪濤，，童榮生，

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥學部，四川 成都 610072；2.電子科技大學醫學院，四川 成都 611731)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是臨床常見的惡性血液腫瘤疾病，其發病率高，進展迅速，且在兒童中更為顯著[1]。甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是治療ALL的一線藥物，MTX是一種競爭性葉酸還原酶抑制劑，通過與二氫葉酸還原酶的結合阻礙四氫葉酸合成，進而抑制腫瘤細胞的生長繁殖。與常規劑量MTX相比，大劑量甲氨蝶呤(HD-MTX)可更好地克服耐藥性，故廣泛用于髓外白血病的防治。不同患者對MTX的敏感性及耐受程度不同，可能出現不同的化療副反應，藥物基因多態性(SNP)被認為是影響HD-MTX不良反應的重要因素之一[2]。本研究擬探討亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的SNP與ALL患兒使用HD-MTX后不良反應發生的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2015年10月至2018年9月在四川省人民醫院兒科血液組確診為ALL的住院漢族患兒70例。具體診斷標準、危險度分型及治療方案均參照兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂)[3]。所有納入研究的患兒處于HD-MTX鞏固化療階段，年齡0～16歲；排除早期強化治療后未完全緩解以及HD-MTX 化療前血常規和肝腎功、電解質、心肌酶學指標不正常者。其中男45例，女25例，年齡(8.27±4.65)歲；免疫分型B型患兒44例，T型12例，其他12例；危險度分級[3]：標危患兒3例，中危18例，高危49例。該研究在中國臨床實驗中心注冊，通過我院醫學倫理委員會批準，所有對象的診療已征得監護人同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1給藥方法 參照兒童ALL 診療建議[3]，MTX 以低危組為2.0 g / m2，中危及高危組均為 5.0 g/m2的劑量給藥，總劑量的 1 /10作為突擊量于前 30 分鐘內快速靜脈滴入，余量于后 23.5 h內勻速滴入。突擊量MTX 滴入后 0.5～2 h，進行三聯鞘內注射 (MTX12.5 mg、阿糖胞苷35 mg，地塞米松5 mg)。

1.2.2MTX血漿濃度測定 經HD-MTX治療患兒于靜脈滴注MTX后24 h、48 h、72 h采對側上肢靜脈血2 ml于抗凝管中，使用均相酶放大免疫分析技術(EMTI)(西門子Viva-E全自動分析儀)測定MTX血漿濃度。

1.2.3基因分型檢測 采外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝，用血液基因組柱式小量提取試劑盒(康為世紀公司，批號：20228)提取基因組DNA，微量核酸蛋白檢測儀(NanoDrop 2000)檢測DNA 濃度和純度，濃度：10～30 ng/μl；A260/A280：1.6～2.0。MTHFR基因分型采用MTHFR基因檢測試劑盒(武漢友芝友醫療科技股份有限公司，批號：18030502)。實時熒光定量PCR(ABI7500)進行擴增，擴增條件：37 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s共40個循環。

1.3不良反應評價監測根據美國國立癌癥研究所常見不良反應評價標準(NCI-CTCAE V4.0) 對患兒進行HD-MTX鞏固化療期首次HD-MTX給藥后7天內產生的不良反應進行統一評價，若分級≥2則被認為是發生臨床相關的化療不良反應。評價觀察主要不良反應(ADR)包括：骨髓抑制、肝功能異常、胃腸道反應、黏膜損害、皮疹、繼發感染、神經系統毒性以及腎功能損害。

1.4統計學方法采用SPSS 23.0統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，非正態分布數據表示為“中位數(Q25，Q75)”。秩和檢驗比較基因多態性與MTX48 h劑量校正濃度差異，卡方檢驗分析MTHFR各基因型分別與72 h血藥濃度是否>0.1 μmol/L 和不良反應是否發生的相關性，并根據野生型及突變型進行分組比較；Logistic回歸分析年齡、性別、BMI、免疫分型、危險度分型、MTX給藥劑量、血藥濃度、基因型等因素與不良反應發生的相關性。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1基本人口學信息該研究共納入70例患兒，基因分型結果MTHFR C677 T中野生基因型CC型患兒25例，突變基因型CT型37例，純合突變基因型TT型8例；MTHFRA1298C中野生基因型AA型患兒38例，突變基因型AC型28例，純合突變基因型CC型4例。該研究所涉及所有基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05)。

2.2基因型與HD-MTX化療后MTX濃度的關系

用藥24 h血藥濃度數據缺失較多，予以剔除，不做分析。因血藥濃度監測方法限制(最低檢測限0.1 μmol/L)，用藥48 h血藥濃度以具體數值表示，用藥72 h血藥濃度以≤0.1 μmol/L或>0.1 μmol/L具體患兒例數表示。MTHFR C677 T、A1298C不同基因型的用藥48 h劑量校正濃度之間差異無統計學意義(P> 0.05)，MTHFR C677 T、A1298C不同基因型與用藥72 h血藥濃度是否>0.1 μmol/L差異無統計學意義(P> 0.05)，見表1。

表1 不同基因型血藥濃度的差異

2.3基因型對不良反應發生的影響統計顯示骨髓抑制發生率最高，共38例(54.2%)，肝功能異常23例(32.9%)，胃腸道反應15例(21.4%)，黏膜損害27例(38.6%)，皮疹4例(5.7%)，繼發感染29例(41.4%)，神經系統損害4例(5.7%)，腎功能損害發生最少，僅2例(2.9%)。其中，僅觀察到MTHFR C677 T CC型(11例)組的胃腸道反應發生高于CT型(3例)、TT型(1例)組差異有統計學意義(P< 0.05)。

2.4多因素對不良反應的發生的影響Logistic回歸分析提示：72 h血藥濃度>0.1 μmol/L患兒更易發生胃腸道不良反應；C677 T 基因多態性也是胃腸道反應的發生的影響因素之一；BMI值、免疫分型可能是患兒發生黏膜損害的影響因素，且提示T系患兒更易發生黏膜損害；體重的數值可能影響患兒皮疹發生。見表2。

表2 ADR發生的影響因素分析

3 討論

MTHFR是葉酸循環中有重要作用的酶，催化5，10-亞甲基-THF還原為5-甲基-THF。鄢歡等[4]發現677C/T型基因突變使纈氨酸替代丙氨酸，導致MTHFR酶的活性下降，造成細胞內同型半胱氨酸濃度增高，改變了葉酸分布；MTHFR 1298中C堿基替換了A堿基后，谷氨酸被丙氨酸所替代，導致MTHFR活性降低，兩者的突變均會對葉酸體內代謝造成影響。本研究發現C677 T位點 CC型發生胃腸道反應的概率顯著高于突變型(CT+TT型)，可推測677CC型患者可能出現更嚴重的藥物毒性反應，其 C>T位點的突變可能對胃腸道有一定的保護作用。Zhu報道[5]C677 T與HD-MTX所致胃腸道反應發生相關，提示C677 T位點多態性可能是HD-MTX化療后胃腸道反應發生與否的重要因素之一。目前關于MTHFR A1298C 基因型與HD-MTX 化療相關不良反應亦有較多報道，但結論不一致[6，7]。本研究未發現A1298C基因型與血藥濃度和不良反應的相關性，可能需要進行多中心、大樣本的研究來驗證。

FDA建議臨床可通過監測MTX血藥濃度來指導個體化用藥，達到提高療效并減少不良反應發生的目的，MTX 24 h血藥濃度可用于預測療效，而48、72 h血藥濃度則用于反映MTX在體內的消除情況、特別是72 h是否≤0.1 μmol/L用于指導CF解救療程以及預防不良反應的發生[8]。本研究結果顯示72 h血藥濃度可能影響患兒胃腸道反應的發生，魏盈盈等[9]的研究也有相同結論，提示血藥濃度監測對于HD-MTX的安全用藥具有積極的指導作用。該研究分析得到患兒在給藥前的BMI值、免疫分型類型及體重數值可能分別為HD-MTX所致黏膜損害、皮疹的發生的危險因素。提示在ALL患兒的臨床治療中，密切監控患兒的體重、BMI數值等指數，明確做好患兒免疫分型，對臨床治療ALL患兒，減少HD-MTX化療不良反應有積極作用。

近年來，許多學者認為MTHFR基因多態性可以作為ALL預后及化療相關不良反應的預測指標，部分醫院已經將藥物基因檢測項目納入醫院常規檢測項目，用于指導疾病的治療與預后[10]。本研究病例數量有限，但其結果可為兒童安全應用HD-MTX提供參考建議，為后續相關研究提供信息。