慢性髓細胞白血病不同臨床緩解狀態下的T細胞亞群特點研究

代景瑩，鄒孟穎，楊 曦，魏 卿，王 宇，李 慧，黃曉兵，王曉冬

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院血液內科，四川 成都 610072)

慢性髓細胞白血病(CML)在酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)時代其療效已得到了革命性的提高[1～3]。但目前仍有一部分患者不可避免地發生疾病進展[4，5]，是否可以從免疫學的角度，通過可行的相關免疫指標對患者的抗腫瘤免疫力進行監測及評估，從而指導療效預測并及時調整治療方案以減少疾病進展，這是一個需要進一步研究的有前景的方向。本研究對CML患者進行了T細胞亞群免疫指標的檢測，以期探討T細胞亞群中各指標的特點是否可對CML患者臨床緩解程度、療效預測起到一定指導意義。

1 資料與方法

1.1一般資料2002年9月30日至2018年9月30日我院血液內科就診并確診為CML慢性期的104例患者，均經骨髓細胞形態學、細胞遺傳學、及分子生物學檢查確診，符合國內統一的診斷與分期標準。

1.2T細胞亞群的檢測采集患者外周血進行流式細胞學檢測T細胞亞群，包括CD8+T細胞比例(CD8+T/Lymphocyte)，CD4+T細胞亞群Th1細胞比例(Th1/ CD4+T)，Th2細胞比例(Th2/CD4+T)，Treg細胞比例(Treg/CD4+T)等。采用BD FACSCanto II流式細胞儀進行檢測，所需免疫熒光抗體-熒光素標記的抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、 IFN-γ、IL-4抗體均購自BD公司、熒光素標記的抗Foxp3抗體購自eBioscience公司。染色過程：①Th1比例和Th2比例：全血+1640混勻，然后加入刺激劑(包括布雷非德菌素A，佛波酯，離子霉素)在孵箱培養4 h；取出后，加入相應標記的抗體，如抗CD3抗體，抗CD8抗體，混勻，室溫孵育20 min；加入10X紅細胞裂解液(BD FACS Lysing Solution)，震蕩，室溫10 min，PBS液洗后，加入相應的固定劑，孵育30 min，PBS洗2遍，各加入IFN-γ抗體和IL-4抗體，孵育20 min；PBS洗1遍，加入適量 PBS重懸待上機檢測。備注：Th細胞的表面標志為CD3+CD4+，而當用PMA刺激4小時時，會發現CD4+的細胞明顯減少，甚至消失，這是因為PMA會誘發細胞表面CD4分子被內吞。所以本研究、亦是通常的做法是用CD3和CD8反設CD4細胞，即CD3+CD8-的細胞被認為是CD3+CD4+的細胞。②Treg比例：全血+1640混勻，然后加入相應標記的抗體，如抗CD3抗體，抗CD4抗體，抗CD25抗體，混勻，室溫孵育20 min；加入10X紅細胞裂解液，震蕩，室溫10 min，PBS液洗后加入相應的固定劑，孵育30 min，PBS洗2遍，加入Foxp3抗體，孵育20 min；PBS洗1遍，加適量PBS液重懸待上機檢測。③CD8+T比例：紅細胞裂解液裂紅處理15～20 分鐘，離心，加入相應熒光標記的抗CD45抗體、抗CD3抗體、抗CD8抗體避光4 ℃孵育20 分鐘，PBS液洗后離心，重懸于適量PBS液待上機檢測。其后進行上機檢測。數據分析采用Diva 流式數據分析軟件進行。

1.3評價標準治療反應定義及療效評估標準參照2013版中國慢性髓系白血病診斷與治療指南。完全細胞遺傳學緩解(CCyR)定義為Ph+細胞為0。主要分子學緩解(MMR)定義為BCR-ABLIS≤0.1%。主要分子學緩解4.5(MR4.5)定義為BCR-ABLIS≤0.0032%。Th1/CD4+T比例引用海斯特檢驗機構的正常參考范圍11.8%～25.8%。

1.4統計學方法采用SPSS 13.0軟件處理數據。計量資料比較采用方差分析及LSD法。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1患者臨床特征將104例患者按照臨床疾病緩解狀態分為未緩解組(未達到CCyR，包括血液學未緩解及血液學緩解但未達到CCyR)(n=24)，CCyR組(n=13)，MR4.5組(n=67)，臨床疾病緩解狀態評估均按照患者進行T細胞亞群檢測當日的臨床狀態進行評估。未緩解組2例伴附加染色體異常，其余102例均不伴隨附加染色體異常。104例患者中，男性占64.42%，女性占35.58%。中位年齡45歲(16～78歲)，發病年齡主要集中在33～56歲。未緩解組男性占75%，女性占25%，中位年齡32.5歲(16～75歲)；CCyR組男性占76.92%，女性占23.08%，中位年齡64歲(25～70歲)；MR4.5組男性占58.21%，女性占41.79%，中位年齡46歲(17～78歲)。

2.23組四種T細胞亞群情況62.50%的未緩解組患者、15.38%的CCyR組患者及15.15%的MR4.5組患者表現出Th1比例(Th1/CD4+T)低于正常參考范圍。未緩解組Th1降低率高于CCyR組和MR4.5組，Th1比例值低于CCyR組和MR4.5組(P< 0.05)，CCyR組與MR4.5組比較差異無統計學意義(P> 0.05)。三組Treg比例(Treg/CD4+T)、Th2比例(Th2/CD4+T)、CD8+T比例(CD8+T/Lymphocyte)比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)。見表1。

表1 3組四種T細胞亞群情況比較 (%)

*與CCyR組和MR4.5組比較，P< 0.05

3 討論

隨著對腫瘤免疫的認識逐漸深入，對腫瘤患者免疫狀態的監測顯得越來越重要，其對于療效預測及預后評估有著重要意義。慢性粒細胞白血病在TKI時代其療效已得到顯著改善，但仍有一部分患者不可避免地出現耐藥、療效不佳，以及發生疾病進展。對CML患者免疫狀態的監測與評估，對于治療方案的指導、療效的預測以及預后的評估可能起著重要指導意義。但以什么免疫指標作為理想的監測指標，以有效評估免疫狀況及指導診療目前尚無統一定論，仍需進一步研究、探討。而T細胞為抗腫瘤免疫中重要的免疫細胞，目前認為細胞免疫應答模式為主要的抗腫瘤免疫應答模式，而其中CD8+T細胞及CD4+T細胞亞群中的Th1細胞為主導細胞免疫應答的T細胞亞群[6]。由此，對CD8+T細胞及Th1細胞的監測對評估CML患者體內的抗腫瘤免疫力可能有著重要指導意義。而CD4+T細胞作為主導體內免疫應答類型的轉化方向的重要輔助性T細胞，其還包括了主導體液免疫應答模式的Th2亞群，主導炎癥反應的Th17亞群，以及主導免疫應答的負向調控的Treg亞群[7]，而Treg細胞在體內的水平一定程度上可反映體內免疫應答受抑制的程度[8]，Th2等其它亞群在體內的水平可從一定角度上反映體內細胞免疫應答的模式是否為主導地位。由此本中心著眼于CD8+T細胞及CD4+T細胞亞群的監測，以期其可有助于對CML患者體內的抗腫瘤免疫力進行評估，并可進一步指導臨床治療、療效預測、與預后評估。

本研究結果顯示，62.50%的未緩解組患者Th1比例值低于正常下限，而只有15.38%的CCyR組患者及15.15%的MR4.5組患者表現出Th1比例值低于正常下限，而未緩解組Th1實際平均值亦低于CCyR組及MR4.5組。Th1水平的降低，可導致體內抗腫瘤細胞免疫應答的降低，此可進一步導致腫瘤負荷的增漲與臨床緩解狀態的不理想。而Th1水平的升高，可促進體內抗腫瘤細胞免疫應答的活化，而其中的效應性CD8+T細胞可進一步執行有效識別、殺傷腫瘤細胞的任務，從而可進一步導致腫瘤負荷的降低與良好的臨床緩解狀態(CCyR或MR4.5)。本研究結果提示，Th1有潛力成為一有意義的免疫監測指標以對療效預測起到一定指導意義。目前國內外對于CML患者Th1水平的相關研究尚較少，但已有研究報道，新診斷CML患者及慢性期CML患者的Th1水平顯著低于健康對照組，提示Th1為一潛在的治療靶點以及能為治療帶來更好的療效獲益，這在研究結論上與本研究一定程度上呈一致[9]。

除此之外，本研究亦對各組的Treg水平、Th2水平及CD8+T細胞水平進行了分析，發現上述3種T細胞亞群在未緩解組、CCyR組與MR4.5組中差異均無統計學意義。Treg一定程度上反映了體內免疫應答受抑制的程度，由本研究結果可見，在三組不同臨床緩解狀態的所致因素中，Treg水平可能并非起主導作用的因素。而Th2細胞為體內主導體液免疫應答模式的輔助性T細胞亞群，目前認為抗腫瘤免疫主要由細胞免疫應答模式介導，本研究結果提示三組患者中Th2細胞介導的體液免疫應答模式并非起主導地位，在導致三組不同臨床緩解狀態的所致因素中，Th2水平亦非起主導作用的因素。CD8+T細胞為執行細胞免疫應答的效應性T細胞，Th1水平的升高會促進CD8+T細胞的活化增殖。本研究中，三組間未觀察到CD8+T比例(CD8+T/Lym)的顯著差異，原因可能有以下幾方面：①本研究中對CD8+T細胞的檢測采用流式細胞學檢測CD8+T細胞數目占淋巴細胞數目的比例，而Th1為淋巴細胞的一部分，由于Th1水平顯著上升，由此上升的CD8+T在CD8+T/Lymphocyte比例上的變化表現得不顯著。②CD8+T細胞總數作為檢測指標不能全面地反映抗CML特異性T細胞的水平。三組不同緩解狀態下的患者體內是否存在抗CML特異性CD8+T水平的差異，而導致臨床緩解狀態的不同，本研究中并未進行深入、具體的研究?？笴ML特異性CD8+T細胞的檢測原理及方法較復雜，并需要較高的成本，由此在作為對CML患者長期監測的免疫指標角度上考慮，抗CML特異性CD8+T細胞是否為一理想免疫監測指標尚難以確定。

綜上，本研究結果提示，不同臨床緩解狀態下的CML患者T細胞亞群特點中，Th1水平為一有顯著性意義的指標，Th1水平與臨床緩解狀態呈現正相關關系。Th1水平有望成為一長期監測的理想免疫指標，從一定角度上協助評估患者的抗腫瘤免疫力，同時可在CML患者的療效預測上起到一定指導意義，并可對緩解狀態不理想的患者及時指導調整治療方案以減少疾病進展。