鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)SHR大鼠Ang II 1型受體蛋白和mRNA表達(dá)的影響

謝 鑫，陳 磊，苗嘉芮，吳成舉，劉文俊，陳 靖，張立德

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

現(xiàn)代生活壓力以及國(guó)際化進(jìn)程，造成精神壓力過(guò)大，很多原發(fā)性高血壓患者臨床表現(xiàn)為：肝陽(yáng)上逆、肝陽(yáng)亢逆無(wú)所制，氣火上擾，從而引起頭目脹痛，急躁易怒，心悸健忘，面紅目赤等癥狀。這些癥狀屬于肝陽(yáng)上亢型高血壓，需要“鎮(zhèn)肝息風(fēng)，滋陰潛陽(yáng)”對(duì)癥治療。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯摘錄于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，用于治療肝陽(yáng)上亢，氣血上逆證型自發(fā)性高血壓，具有顯著的降低血壓療效。血管結(jié)構(gòu)變化是高血壓疾病的重要改變。血管緊張素原(Angiotensin，Ang)是一種肽類(lèi)物質(zhì)，具有血管收縮功能，同時(shí)刺激腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮的功能，醛固酮促進(jìn)遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞Na+重吸收和排放K+，促進(jìn)體內(nèi)Na+和水的儲(chǔ)留[1～3]。體內(nèi)血管內(nèi)容量血液增多以及強(qiáng)烈的血管收縮，導(dǎo)致血壓升高。Ang有七個(gè)亞型，分別為AngⅠ、AngII、AngIII、AngⅣ、AngⅤ、AngⅥ、AngⅦ，其中Ang II具有收縮血管功能作用，是血管緊張素家族中作用最強(qiáng)的分子因子；而Ang II 1型受體(Angiotensin II Type 1 Receptor，AT1R)是Ang II產(chǎn)生血管收縮功能最重要的受體[4，5]。本實(shí)驗(yàn)采用自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)，用中醫(yī)經(jīng)典古方鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯，來(lái)觀察對(duì)SHR大鼠的腹主動(dòng)脈AT1R蛋白表達(dá)和AT1R mRNA表達(dá)的影響，揭示鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)肝陽(yáng)上亢型SHR大鼠降低血壓的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物2016年3月至2017年12月，選擇SPF級(jí)別 SHR大鼠 60 只，健康雄性 24 周齡；12只 SPF 級(jí)別，雄性魏-凱二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)，體重量為：(200±15)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK(京)2016-0011，采購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；大鼠飼養(yǎng)條件為：室溫 21-26 ℃，相對(duì)濕度 46%～56%。采用隨機(jī)數(shù)字表方法將SHR大鼠分成 5 組各12只：模型組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中劑量組，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高劑量組；復(fù)方羅布麻組；12 只WKY大鼠(健康同源雄性)作為正常組。

1.2藥物與試劑鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯：生代赭石30g(先煎)、甘草5 g、黃芩15 g、牛膝30 g、生牡蠣15 g(先煎)、川芎15 g、生地15 g、梔子15 g、白芍20 g、生龍骨15 g(先煎)、玄參15 g、炙龜板15 g(先煎)、丹參20 g、白術(shù)10 g、鉤藤15 g、茯苓10 g等；遼寧中醫(yī)大學(xué)附屬醫(yī)院藥店采購(gòu)實(shí)驗(yàn)中所用的中藥藥材(產(chǎn)地山東)，由張林老師(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方劑教研室)鑒定：中藥藥材均為合格正品；常規(guī)煎煮水提中藥藥材，每副中藥加水8倍量約為：1400 mL，中藥浸泡時(shí)間為：30 min，其中生牡蠣、炙龜板、代赭石、生龍骨先煎為：30 min，再加入鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯藥方中其余的中藥藥材，再次煎煮時(shí)間為：30 min；中藥煎好后，用無(wú)菌紗布(10 層)過(guò)濾，收集中藥藥液。一抗兔抗大鼠AT1R抗體(美國(guó)Abcam company公司)；二抗羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(Horse Reddish Peroxidase，HRP；日本TaKaRa公司)；復(fù)發(fā)羅布麻片I(國(guó)藥準(zhǔn)字：14022937，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)；AT1R引物：上游5’-TCAACCTCTACGCCAGTG-3’，下游 5’e-CAAGCCAGCCATCAGC-3’，GAPDH引物：上游5’-TCGGACGCCTGGTTAC-3’，下游5’-TTCCCATTCTCAGCCTTG-3’，RT-PCR 試劑盒(日本TaKaRa；批號(hào)：RR014 A)；實(shí)時(shí)定量試劑盒(日本TaKaRa；批號(hào)：RR014 A)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI 公司；型號(hào)：9700)；核糖核酸提取試劑盒(美國(guó)Abcam company公司，貨號(hào)：15596026)。

1.3給藥方法按照人體和大鼠體表面積比換算[6]，SHR大鼠給藥等效劑量為：SHR大鼠藥物劑量=X mg/kg×70 kg×0.018/200 g=X mg/kg × 70 kg × 0.018/0.2 kg=6.3 X mg/kg =(172/60)×6.3=18.06 g/kg，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量組、中劑量組和高劑量組用藥劑量分別為：18 g/kg、40 g/kg和80 g/kg，根據(jù)公式換算成中藥濃度為：1 g/ml/2 g/ml，4 g/ml，復(fù)方羅布麻片懸浮液組為：80 g/kg，根據(jù)公式換算成中藥濃度為：0.02 g/ml，4 ml/d。給予每只大鼠灌胃模型對(duì)照組給予0.9% 氯化鈉溶液、小劑量組給予鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 18 g/kg、中劑量組給予鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 40 g/kg，高劑量組給予鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯80 g/kg；陽(yáng)性對(duì)照組給予 80 g/kg；正常對(duì)照組給予0.9% NaCl 溶液。連續(xù)灌胃給藥45天，早晚各一次。

1.4WesternBlotting檢測(cè)每組大鼠取1～2 cm標(biāo)本(主動(dòng)脈弓下段的腹主動(dòng)脈)，每個(gè)樣本使用PBS(美國(guó)Thermofisher公司，產(chǎn)品號(hào)：10010031)沖洗，沖洗后，總蛋白裂解液(美國(guó)Thermofisher公司，產(chǎn)品號(hào)：78510)加入每個(gè)樣本中，使用勻漿機(jī)進(jìn)行組織勻漿(操作均在冰塊中進(jìn)行)；每個(gè)樣本總蛋白定量：使用牛血清蛋白(酚試劑方法)：在波長(zhǎng)為650 nm條件下，測(cè)得每個(gè)樣本的OD值(722分光光度計(jì))；根據(jù)每個(gè)樣本的OD值，把每個(gè)標(biāo)本配成相同體積和相同濃度；把Running Buffer(美國(guó)Thermofisher公司，產(chǎn)品號(hào)：NP0001)加入所有的標(biāo)本中，在100 ℃沸水中，使每個(gè)樣本中的蛋白變性(煮沸時(shí)間為：5 min)；每個(gè)樣本加樣進(jìn)行跑膠(分離膠和濃縮膠跑膠)；取出跑完的膠，將膠體放入轉(zhuǎn)印槽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印(將變性的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上)；轉(zhuǎn)印完畢后，取出轉(zhuǎn)印膜(硝酸纖維素膜)，2 h(5%，伊利脫脂奶粉)封閉轉(zhuǎn)印膜，封閉后使用TTBS(美國(guó)invitrogen公司，產(chǎn)品號(hào)：9404)進(jìn)行清洗(2次，每次5 min)，清洗后轉(zhuǎn)印膜中加入1：1000稀釋的一抗(美國(guó)Abcam company公司)，再加入1：350稀釋的二抗(日本TaKaRa公司)，把加入一抗和二抗后的轉(zhuǎn)印膜放入平皿中，使用TTBS(美國(guó)invitrogen公司，產(chǎn)品號(hào)：9404)進(jìn)行沖洗(2次，每次5 min)，沖洗后的轉(zhuǎn)印膜，按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行ECL發(fā)光檢查每個(gè)樣本中的AT1R蛋白含量。

1.5RealTimeRT-PCR測(cè)定所有的標(biāo)本加入TRIzol(美國(guó)Abcam company公司，貨號(hào)：15596026)試劑，室溫放置5 min，使每個(gè)樣本充分裂解釋放總RNA，提取總RNA后，使用勻漿機(jī)進(jìn)行組織勻漿(操作均在冰塊中進(jìn)行)，勻漿后，每個(gè)樣本加入200 μl氯仿/ml(美國(guó)Amresco公司)，使用4 ℃超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司，型號(hào)：L-80XP)：12000×g，離心15 min，吸取每個(gè)樣本的上清液(棄沉淀)，加入0.5 ml異丙醇/ml(美國(guó)Amresco公司)搖勻；搖勻后，使用4 ℃超速離心機(jī)：12000×g，離心15 min，棄每個(gè)樣本EP管的上清，提取的總RNA沉于EP管底部；加入75% 1 ml乙醇/ml，進(jìn)行搖勻，使用4 ℃超速離心機(jī)：12000×g，離心15 min，再次棄掉每個(gè)樣本EP管中的上清液；Nuclease free water(美國(guó)Abcam company公司，貨號(hào)：AM9937)試劑加入每個(gè)樣本中。260 nm、280 nm波長(zhǎng)測(cè)定每個(gè)樣本的OD值(紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì))；測(cè)定后，根據(jù)測(cè)定每個(gè)樣本的OD值，把每個(gè)樣本配成相同體積和相同濃度，按說(shuō)明書(shū)操作加入RT-PCR(日本TaKaRa；批號(hào)：RR014 A)試劑盒中的試劑，使每個(gè)樣本中提出的mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再加入Real-time PCR(日本TaKaRa；批號(hào)：RR014 A)試劑盒中的試劑，按說(shuō)試劑盒中的明書(shū)，進(jìn)行樣本的實(shí)時(shí)定量PCR 擴(kuò)增操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，選用ONE WAY ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示各組數(shù)據(jù)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1WesternBlotting結(jié)果與模型組比較，正常對(duì)照組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中劑量、高劑量和復(fù)方羅布麻組中AT1R蛋白表達(dá)明顯降低(F=863.465，P< 0.01)。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 AT1R 和GAPDH 蛋白表達(dá)

圖2 AT1R/GAPDH 灰度值比較 *與模型組比較，P < 0.01 A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量組；D：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中劑量組；E：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高劑量組；F：復(fù)方羅布麻組

2.2RealTimeRT-PCR結(jié)果與模型組比較，正常對(duì)照組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中劑量高劑量和復(fù)方羅布麻組中AT1R mRNA的表達(dá)明顯降低(F=863.465，P< 0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 AT1R/GAPDH mRNA擴(kuò)增比值 *與模型組比較，P < 0.01 A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低劑量組；D：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯中劑量組；E：鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高劑量組；F：復(fù)方羅布麻組

3 討論

現(xiàn)代快速生活節(jié)奏，造成高血壓疾病的患者日益增多，其中高血壓疾病分為兩種：原發(fā)性高血壓和.繼發(fā)性高血壓，原發(fā)性高血壓占高血壓疾病的90%以上[7～9]。血壓升高最起始影響的原因是血管收縮的改變，血管收縮最重要的影響因子是Ang II，引起Ang II收縮血管生物學(xué)效應(yīng)的最重要的受體是AT1R，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，Ang II與AT1R結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的血管收縮效應(yīng)[10～12]。Ang II與AT1R結(jié)合后，使AT1R活化后，通過(guò)激活磷脂酶C和增加細(xì)胞內(nèi)Ca+濃度，引起強(qiáng)烈的收縮血管作用，同時(shí)刺激醛固酮合成和分泌，增加體內(nèi)的Na+和水的儲(chǔ)留，有效的提高體內(nèi)的循環(huán)血量，進(jìn)一步的提高收縮血管帶來(lái)的高血壓的生物學(xué)效應(yīng)[13～16]。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯出自《醫(yī)學(xué)衷中西參錄》，其藥方成分作用：牛膝生代赭石相伍，剛?cè)岵⑦M(jìn)，重用牛膝，將隨風(fēng)上逆的血引而下行；生代赭石色赤而入血，石體質(zhì)重而下行，平定上逆之挾血肝風(fēng)；牡蠣、龍骨和龜板合用，具有滋陰潛陽(yáng)的作用；牡蠣為水中之物，入藥將浮越之陽(yáng)潛降于水中[17]。經(jīng)典中藥方鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯是具有“鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，滋陰潛陽(yáng)”的功效，顯著有效的治療肝陽(yáng)上亢型自發(fā)性高血壓，改善頭目眩暈、目脹耳鳴、心中煩熱、脈弦長(zhǎng)有力、肢體漸覺(jué)不利、眩暈、精神萎靡等臨床癥狀。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可以調(diào)低SHR大鼠腹主動(dòng)脈血管組織中AT1R蛋白表達(dá)和AT1R mRNA 表達(dá)，減少SHR大鼠的血管收縮能力，起到有效降低SHR大鼠血壓作用。