重組雞Ex-FABP蛋白對福美雙誘導的TD肉雞血清中Bcl-2含量的影響

賈云飛，楊世雄，田志雄，張陽陽，牛 勝，孫 巨，寧官保，張 鼎，趙宇軍，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801）

肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial dyschondroplasia，TD）是肉雞生長過程中常見的腿病之一，是LEACH和NESHEIM在1965年初次發(fā)現(xiàn)并報道[1]，以軟骨內(nèi)血管內(nèi)皮細胞凋亡、軟骨鈣化受阻和脛骨近端過渡期軟骨細胞大量增生為特征，可引起肉雞腿部變形、生長性能下降等一系列不良影響[2]。有研究表明，在飼料中提高鈣磷比例或添加維生素D和1，25（OH）2-VD3能有效減少肉雞 TD 的發(fā)生率[3]。ROBINSON等[4]研究指出，2周齡肉雞生長速度過快時，TD的發(fā)生率更高。自然發(fā)生和人工誘發(fā)的TD，在1～2周齡的肉雞和火雞群中可明顯觀察到特征性癥狀[5]，脛骨關(guān)節(jié)處的縱切面可見異常增厚的色如白玉的軟骨栓，軟骨內(nèi)無血管且質(zhì)脆[6]，顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞大且排列緊密，細胞間未發(fā)現(xiàn)血管、破骨細胞和成骨細胞[7]。

福美雙作為一種低毒抑菌殺蟲劑，廣泛用于植物殺蟲劑和工業(yè)橡膠的促進劑，現(xiàn)已被廣泛用于高精度TD模型的誘導，并用于TD研究[8-9]。B細胞淋巴瘤因子 2（B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2）蛋白家族是細胞凋亡中重要的調(diào)控因子，它們大多自然分布于線粒體外膜上，或在凋亡信號刺激后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜發(fā)揮作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在受損傷的腦中Bcl-2表達上調(diào)并在一定程度上抑制神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡[10]。Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）是與 Bcl-2相互拮抗的重要調(diào)控基因，細胞凋亡取決于Bax和Bcl-2自身的表達水平和比值。Bax表達量的相對增加，會形成Bax-Bax同源二聚體，可促進細胞凋亡；Bcl-2相對表達量的增加，形成的Bax-Bcl-2異源二聚體，則會抑制細胞凋亡。它們的作用機制是通過改變線粒體膜通透性來實現(xiàn)抑制或促進釋放凋亡相關(guān)因子（如Cytc），從而決定是否激活半胱氨酸蛋白酶類依賴性細胞凋亡途徑而控制細胞凋亡[10]。細胞外脂肪酸結(jié)合蛋白（extracellularfattyacid-bindingprotein，Ex-FABP）是在軟骨細胞分化后期合成和分泌的低分子量蛋白，最初在靜止期的雞胚成纖維細胞和心肌心間干細胞中發(fā)現(xiàn)，被稱為20K轉(zhuǎn)化敏感蛋白[11]。Ex-FABP可以抑制細胞分裂[12]，參與機體的炎癥反應(yīng)，還具有抗菌功能[13]。同時Ex-FABP也可以發(fā)揮細胞存活蛋白維持細胞活力，它可以抑制軟骨細胞凋亡，故也稱作軟骨相關(guān)蛋白[14]。山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院生物制品實驗室前期由TIAN等[15]利用基因芯片技術(shù)和抑制消減雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)Ex-FABP在肉雞TD中存在差異性表達。

本試驗通過將重組Ex-FABP蛋白注射入試驗肉雞體內(nèi)，以探究重組Ex-FABP蛋白對肉雞血清中Bcl-2含量的影響，為TD的防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

90羽1日齡艾維茵（AA）肉雛雞，購自山西大象農(nóng)牧集團有限公司。

1.2 試驗試劑

IPTG、硫酸卡那霉素，購于北京索萊寶生物科技有限公司；福美雙（JL131223002），購自美國Amresco公司；Bcl-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，購于南京建成生物工程有限公司；含Ex-FABP基因的重組大腸桿菌，由山西農(nóng)業(yè)大學生物制品實驗室提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 Ex-FABP重組蛋白的誘導表達純化 試驗在山西農(nóng)業(yè)大學生物制品實驗室進行，該實驗室前期已成功構(gòu)建含Ex-FABP基因的重組大腸桿菌，將其在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和大錐形瓶LB培養(yǎng)液中使其大量繁殖表達Ex-FABP蛋白。在細菌培養(yǎng)液OD600值達0.4～0.7時，每升培養(yǎng)液中加入8 mL誘導劑IPTG，37℃誘導培養(yǎng)21 h，在4℃條件下用PBS緩沖液離心洗滌得到重組大腸桿菌。將得到的目的菌在冰上進行超聲波碎菌、離心，取其上清液通過0.45 μm過濾器過濾收集過濾液，再利用鎳柱親和層析方法，透析、濃縮得到純化的Ex-FABP蛋白。

1.3.2 試驗動物分組及處理 本試驗在山西農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心進行，將90羽1日齡AA肉雞預飼養(yǎng)7 d后，隨機分為9組，每組10羽，其中，4組為添加福美雙的日糧組（福美雙組，1～4組），在8，9日齡時將含100 mg/kg福美雙的日糧連續(xù)飼喂2d以誘導TD模型，并在10，12，15日齡時每組分別于腿部肌肉注射低（20 μg/kg，第1 組）、中（50 μg/kg，第2組）、高（100 μg/kg，第3組）劑量的重組Ex-FABP蛋白和等體積PBS緩沖液（第4組）；另外4組為健康組（5～8組），飼喂正常日糧，在10，12，15日齡時每組分別腿部肌肉注射低（20 μg/kg，第 5 組）、中（50 μg/kg，第 6 組）、高（100 μg/kg，第 7組）劑量的重組Ex-FABP蛋白和等體積PBS緩沖液（第8組）；另設(shè)一組為空白對照組（第9組），正常飼喂，不做任何處理。

1.3.3 試驗雞血清的采集 將飼喂福美雙日糧的最后一天（9日齡）作為試驗第1天，分別在試驗第6天（14日齡）、第10天（18日齡）、第15天（23日齡），每組隨機選取3只雞進行心臟采血，待血液自然凝固后，使用離心機3 000 r/min離心15 min，小心吸取血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 Bcl-2含量測定 通過競爭ELISA法測定Bcl-2含量，并嚴格按照Bcl-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進行操作，在Excel軟件中創(chuàng)建一個對數(shù)坐標圖，標準物的濃度取對數(shù)值為縱坐標，OD值取對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線并得出回歸方程，將待測樣品的OD值代入回歸方程即可計算出每個樣本的Bcl-2蛋白濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bcl-2標準曲線的繪制

利用標準孔濃度和OD值得到標準曲線（圖1）和回歸方程：y＝0.113x＋0.215 7，R2＝0.996。

2.2 樣品血清中的Bcl-2濃度

由圖2可知，試驗第6天時，與福美雙組中的對照組（處理4）相比，中劑量、高劑量福美雙組血清中Bcl-2蛋白濃度較高（P＜0.05）；低劑量、高劑量健康組相比健康對照組（處理8）血清中Bcl-2蛋白濃度顯著較高（P＜0.05）；福美雙各組和低劑量、高劑量健康組與空白對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）。

由圖3可知，試驗第10天時，中劑量、高劑量福美雙組與福美雙對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度無明顯差異（P＞0.05）；中劑量、高劑量健康組與健康對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）；中劑量、高劑量的福美雙組和健康組與空白對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）。

由圖4可知，試驗第15天時，低劑量福美雙組與福美雙對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05），高劑量組則顯著降低（P＜0.05）；中劑量福美雙組與福美雙對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度無明顯差異（P＞0.05）；低、中、高劑量健康組血清中Bcl-2蛋白濃度與健康對照組相比顯著升高（P＜0.05），除高劑量福美雙組外，其余福美雙組與健康組和空白對照組相比，血清中Bcl-2蛋白濃度顯著升高（P＜0.05）。

3 討論

Ex-FABP蛋白作為一類重要的軟骨相關(guān)蛋白，在正常情況下，關(guān)節(jié)軟骨分泌量少且只出現(xiàn)于肥大軟骨細胞，而在TD肉雞的生長板中有大量前肥大細胞堆積，進一步分化、成熟受阻，不能分化為成熟的肥大細胞，在這些前肥大細胞中異常出現(xiàn)大量Ex-FABP蛋白[16]，這表明Ex-FABP蛋白對TD的恢復可能起到非常重要的作用。根據(jù)TD的發(fā)病特點，得知TD的發(fā)生過程中存在軟骨生長板細胞發(fā)生凋亡，無法為軟骨細胞鈣化提供所需要的營養(yǎng)與氧氣而導致軟骨細胞鈣化異常從而發(fā)生TD。Bcl-2作為一類極其重要的抗凋亡因子，可能在TD的恢復過程中起到重要的作用，所以，本試驗通過細胞凋亡途徑來探究重組雞Ex-FABP蛋白對TD肉雞的治療機制。

試驗結(jié)果顯示，在試驗第6天，誘導TD發(fā)生后血清中Bcl-2的蛋白表達顯著上調(diào)，這表明在誘導TD發(fā)生初期，機體中Bcl-2的蛋白表達受到誘導，從而增強軟骨生長板細胞的抗凋亡作用。張寧等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在誘導的TD發(fā)生后，肉雞血清中促凋亡蛋白Bax的含量顯著升高[17]，這可能是通過促進促凋亡因子的表達造成了凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，機體通過誘導抗凋亡因子Bcl-2的表達，以抵抗凋亡現(xiàn)象的惡化[18]。除此之外，對TD肉雞注射中劑量和高劑量重組Ex-FABP蛋白后，血清中Bcl-2的蛋白表達顯著升高，而對健康肉雞注射低劑量和高劑量重組Ex-FABP蛋白后，Bcl-2的蛋白表達顯著升高，這表明在TD發(fā)生初期中劑量和高劑量的重組Ex-FABP蛋白對血清中Bcl-2的蛋白表達有顯著的促進作用。在TD發(fā)生各階段，TD肉雞與健康肉雞相比，Bcl-2的蛋白表達基本呈顯著上調(diào)趨勢，這表明在TD的發(fā)展過程中血清中Bcl-2的蛋白表達有顯著增強作用，這可能是在抑制TD的進一步發(fā)展。在試驗的第15天，注射低劑量的重組Ex-FABP蛋白組，與第6，10天相比，血清中Bcl-2的蛋白表達量顯著增高，說明低劑量對促進Bcl-2蛋白表達的作用相對遲緩，而高劑量組Bcl-2的蛋白表達水平顯著降低，這可能與后期TD恢復有關(guān)，充分說明Ex-FABP蛋白可以通過促進抗凋亡因子Bcl-2表達來抑制脛骨軟骨生長板細胞凋亡的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究表明，重組雞Ex-FABP蛋白可以通過促進機體血清中抗凋亡因子Bcl-2的表達來抑制脛骨軟骨生長板細胞凋亡，從而發(fā)揮治療作用，這將為研制Ex-FABP生物制劑防治肉雞TD奠定理論基礎(chǔ)。