桉樹凋落物對土壤微生物群落的影響：基于控制實驗研究*

陳法霖 張 凱 向 丹 吳愛平 李有志 鄒冬生 鄭 華

（1湖南農業大學生物科學技術學院，洞庭湖區農村生態系統健康湖南省重點實驗室，長沙 410128）（2中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室，北京 100085）（3新疆農業大學草業與環境科學學院，烏魯木齊 830052）（4 青島農業大學資源與環境學院，山東青島 266109）

用速生外來樹種（如：桉樹、濕地松）取代原生森林人工造林是中國乃至全球的主要生態變化之一。原產于澳大利亞的桉樹（Eucalyptus），由于其生長速度快，適應性強、輪伐期短，且用途廣，經濟效益高等特點，已成為我國南方地區主要造林樹種之一。至2015年，我國桉樹造林面積已超過450萬hm2［1］。由于桉樹對原生生態系統具有潛在的破壞性影響，隨著桉樹人工林面積的不斷擴大，桉樹種植對森林生態系統的影響越來越受到社會的關注。已有研究表明：桉樹取代原生生態系統造林導致的生態退化通常表現為生物多樣性減少及功能退化［2-4］、林地土壤退化［5-7］等，且在國外亦有關于桉樹的類似報道［8-12］。但是，有關桉樹對華南地區森林土壤微生物群落影響的研究較少，桉樹種植影響下土壤微生物群落的變化以及由此導致的生態系統過程變化的機制和效應尚未闡明。探討桉樹對土壤微生物群落及其生態功能的影響，對于全面科學地評價桉樹的生態影響，揭示桉樹影響生態系統生物地球化學循環的機理具有重要意義。

桉樹造林對土壤微生物群落的影響大致包括以下四種途徑：（1）桉樹高效的生長速率導致土壤養分的消耗，從而降低土壤微生物所需養分資源的可利用性；（2）通過凋落物分解和根系分泌物對土壤微生物產生影響；（3）通過影響林下植被多樣性和豐富度間接影響土壤微生物；（4）林地管理措施，如施肥、煉山等對土壤結構和養分的直接影響進而改變土壤微生物群落結構和功能。以上各因素之間又相互聯系并協同影響土壤微生物群落及功能。

野外研究發現，與天然次生林等原生森林相比，桉樹取代原生森林造林導致林地土壤微生物群落的生物量、多樣性以及酶活性下降［4,13］。但是在野外條件下，人工林管理對森林生態系統的干擾較大，難以將桉樹本身對土壤微生物群落的影響抽離出來。凋落物是森林生態系統土壤微生物群落食物的主要來源之一。本研究采用室內縮微模擬的方法，研究原生森林土壤微生物群落結構及其功能對桉樹凋落物的響應，為闡明桉樹通過凋落物途徑導致的土壤微生物群落變化以及由此導致的生態系統過程變化的機制和效應提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

縮微模擬試驗的土壤選自海南省白沙縣細水鄉龍村小流域。該區域屬熱帶濕潤季風性氣候，年均降雨量約1725 mm，70%～80%的降水集中在5—10月。年均氣溫21.9～23.4℃，最高溫度35～37℃，最低溫度5～6℃。土壤母質屬于花崗巖風化物，土壤類型為磚紅壤。地帶性森林群落為熱帶季雨林。該小流域天然次生林中物種豐富，喬木物種主要有厚皮樹、對葉榕、銀柴、木棉、倒吊筆、菲律賓合歡、海南紅豆、海南蒲桃、楓香、黃牛木、毛果扁擔桿、水錦樹、越南山礬等。桉樹是該區域的重要人工造林樹種，速生人工造林以尾葉桉、巨尾桉等為主，造林方式通常為同一品種大面積種植，喬木層物種較為單一。

1.2 試驗設計

采用隨機區組設計，用塑料盆缽進行喬木凋落物（葉凋落物）的分解模擬試驗。供試土壤選自小流域中土壤肥力水平有差異的3片天然次生林的土壤，根據有機碳和全氮含量，土壤肥力水平分別為高、中、低（表1）。土壤及凋落物的采集時間為2011年10月。

表1 供試土壤性質Table 1 Properties of the tested soils

土壤去除碎礫、根系等雜質后過2 mm篩，混勻移至塑料方口小盆（邊長8 cm、深度10 cm）中。每個小盆含有相當于200 g干土的鮮土，調整土壤含水量至30%。凋落物設置3個水平，分別為海南天然次生林的混合喬木葉凋落物（NSF，Natural secondary forests）和桉樹人工林中收集的桉樹新近葉凋落物（EP，Eucalyptusplantations），并設置不添加凋落物的對照（CK）。將凋落物弄碎成0.5 cm×0.5 cm大小，混勻后稱取各凋落物2 g（風干后葉重）至各小盆中，并與土壤混勻。

按照土壤肥力水平分別設置高、中、低3個區組，每個區組設置9個小盆（3盆添加桉樹葉凋落物，3盆添加天然次生林混合葉凋落物，3盆不添加凋落物），共27盆。添加凋落物后土壤培養在可控溫控濕的培養箱內，培養箱溫度設置為25℃，濕度設置為90%，每個光照周期為16 h光照，8 h黑暗。定期根據調整好含水量后的初始質量補充超純水以保證土壤水分條件的一致性。

1.3 樣品采集與測定

培養實驗共進行30 d，每10天取一次樣，每次各土壤肥力水平下的3種凋落物處理各取1盆。采集的土壤樣品過2 mm孔徑的土壤篩再次勻質化，并去除還未腐解的大塊凋落物。過篩后的土壤一部分冷凍干燥后，磨碎并過100目土壤篩，保存于-20℃用于土壤PLFA的提??；一部分放在4℃保存用于土壤微生物群落碳源代謝功能的測定。

供試土壤性質的測定參考《土壤農化分析》［14］。供試凋落物初始C、N的含量用德國Elementar公司生產的Vario Ⅲ分析儀測定。

1.4 土壤微生物磷脂脂肪酸譜圖分析

土壤微生物磷脂脂肪酸的分析方法在Buyer等［15］的方法上加以改進。所用實驗用品和器皿均為玻璃或特氟龍（Teflon）材質，不使用清洗劑清洗，經10%的HCl浸泡后，于高溫下烘干去除磷脂污染，并在使用前經過正己烷潤洗。提取以及保存均避光、避熱、避氧。

提?。? g凍干土（100目）至40 mL玻璃離心管，依次加入3.2mL磷酸緩沖液（pH 7.4）、8 mL甲醇、4 mL氯仿；室溫超聲浸提10 min后避光水平震蕩1h，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清至100 mL分液漏斗；依次加入3.2 mL磷酸緩沖液及4 mL氯仿，充分混勻，置于分液漏斗架上，過夜避光分層；收集下層氯仿相至40 mL離心管，N2吹干。

分離：樣品過硅膠柱（500 mg silica gel column，Part No.5982-2265，Agilent Technologies，Wilmington，DE，USA）前先加入5mL氯仿潤濕硅膠柱；用10 mL氯仿分2次洗滌轉移N2吹干的樣品至硅膠柱內；待氯仿滴干后加入10 mL丙酮過硅膠柱；待丙酮完全滴干后，加入5 mL甲醇（色譜純）過硅膠柱，收集甲醇相至10 mL Teflon離心管，N2吹干。

甲酯化：用1 mL甲醇-甲苯（1∶1，v/v）溶液將N2吹干的脂類物質溶解；加入0.2 mol·L-1KOH（現用現配，甲醇做溶劑）1 mL，混勻，35℃溫育15 min；待樣品冷卻至室溫后，依次加入2 mL氯仿-正己烷（1∶4,v/v）、1 mL 1 mol·L-1醋酸、2 mL超純水，充分震蕩混勻；2 000 r·min-1離心5 min，轉移上層正己烷相至另一干凈的10 mL玻璃樣品瓶；用2 mL氯仿-正己烷（1∶4,v/v）重復提取一次，合并兩次提取的正己烷相，N2吹干，-20℃保存。

上機前準備：樣品過柱（NH2SPE column，Part No. 8B-S009-EAK，Phenomenex，Torrance，CA）前先加入1 mL氯仿潤濕柱子；用1 mL氯仿分2次洗滌轉移吹干的樣品至柱子內；收集氯仿相至2 mL棕色樣品瓶，N2吹干；加入1 mL含有10 mg·L-1內標物（十九烷酸甲酯）的正己烷（農殘級）溶液。

鑒定（GC-MS條件）：HP6890/MSD5793（Agilent Technologies，Bracknell，UK），HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流進樣。進樣口溫度230℃；檢測器溫度270℃。升溫程序：50℃持續1 min，以15℃·min-1增加至150℃，保持2 min，再以3℃·min-1增加至250℃，保持15 min。He作載氣，流量為1 mL·min-1。

1.5 土壤微生物群落碳代謝功能分析

微生物群落碳源代謝功能應用BIOLOG微生物自動分析系統進行測定［16］。稱取相當于10 g干重的鮮土，加90 mL無菌的0.85% NaCl（質量比）溶液在搖床上180r·min-1往復式振蕩30min，然后將土壤懸濁液再梯度稀釋2次，每次稀釋10倍；用多通道移液器吸取稀釋1000倍后的土壤懸浮液接種至生態板（BIOLOG-ECO PLATE）的每一個孔中，每孔150μL。將接種好的生態板放置于25℃恒溫箱中培養240h，每12h于BIOLOG儀上讀取波長為590 nm處的OD值。

1.6 數據處理

磷脂脂肪酸的定量用峰面積和內標(19:0)曲線法。PLFA含量用nmol·g-1表示。本研究共有24種PLFA被檢出。這些脂肪酸主要由飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、帶甲基支鏈的脂肪酸和帶環丙基的脂肪酸組成。主要微生物類群的生物量通過以下PLFA的總量來估算：細菌（15:0、17:0、20:0、革蘭氏陽性細菌：i15:0、a15:0、i16:0、i17:0、a17:0、i18:0；革蘭氏陰性細菌：16:1ω9t、16:1ω7c、cy17:0、18:1ω9t、18:1ω7c、cy19:0）；用16:1ω5c、18:2ω6,9c、18:1ω9c的和來估算真菌的生物量；用10Me17:0、10Me18:0與10Me19:0的和來估算放線菌的生物量，14:0、16:0、18:0為通用脂肪酸［17-21］。

BIOLOG生態板的平均顏色變化率（Average well colour development，AWCD）計算公式為［22］：AWCD=∑（C-R）/n，C為每個有培養基孔的OD值，R為對照孔的OD值，n為培養基碳源種類，生態板n值為31。采用曲線整合方法［23］估計土壤微生物群落的碳代謝活性：梯形面積S=∑［（vi+vi-1）/2（ti+ti-1）］，vi為i時刻的AWCD值。用培養72 h的數據來分析微生物群落的碳代謝多樣性特征：包括利用碳源的豐富度（Richness，S）、香農多樣性指數（Shannon index，H′）。香農多樣性指數的計算公式為：H′=-∑PilnPi，其中Pi=ni/N，ni為第i種培養基的OD值，N為樣品中所有培養基OD值的總和；利用碳源的豐富度以（C-R）＞0.25的數據為準。

用方差分析（analysis of variance, ANOVA）確定不同凋落物處理間土壤微生物群落的磷脂脂肪酸豐度、碳代謝活性及多樣性是否有顯著差異，用Duncan法進行多重比較。主成分分析（Principal component analysis，PCA）用于土壤微生物群落磷脂脂肪酸組成和碳代謝方式的差異性分析。統計分析通過SPSS 16.0統計軟件實現。

2 結 果

2.1 凋落物碳氮含量

桉樹凋落物單位質量的總碳含量顯著高于天然次生林的混合凋落物（表2，P＜0.01），總氮含量則顯著低于天然次生林的混合凋落物（表2，P＜0.01）。桉樹凋落物的總碳和總氮含量分別為529.7 mg·g-1和6.94 mg·g-1，而天然次生林混合凋落物的總碳和總氮含量分別為474.8 mg·g-1和13.51 mg·g-1。天然次生林混合凋落物的碳氮比35.2，而桉樹凋落物的碳氮比則有76.3，顯著高于天然次生林的混合喬木凋落物（表2，P＜0.01）。

表2 供試天然次生林與桉樹林凋落物的性質Table 2 Properties of the litters of natural secondary forests and Eucalyptus plantations

2.2 土壤微生物群落磷脂脂肪酸豐度

無論是革蘭氏陽性菌，還是革蘭氏陰性菌的特征脂肪酸豐度，桉樹人工林凋落物處理的土壤均顯著低于天然次生林混合凋落物處理的土壤（P＜0.05）。添加凋落物培養10、20、30 d，天然次生林混合凋落物處理土壤中細菌特征脂肪酸的總豐度分別較桉樹人工林凋落物處理的土壤高13%、9%和5%，其中10d時（初期）達到顯著水平（P＜0.05）（圖1a）。

不同凋落物處理土壤真菌特征脂肪酸的豐度差異較大。天然次生林混合凋落物處理土壤中真菌的豐度顯著高于桉樹凋落物處理的土壤，培養10、20、30 d時，分別比后者高41%，27%和43%（圖1b，P＜0.05）。天然次生林凋落物處理土壤的放線菌特征脂肪酸的豐度稍高于桉樹凋落物處理的土壤，但是差異未達到顯著水平（圖1c）。

添加凋落物的土壤磷脂脂肪酸總量顯著高于未添加凋落物的土壤，兩種凋落物處理土壤磷脂脂肪酸總量間的差異也達到顯著水平（圖1d，P＜0.05）。凋落物培養10、20、30 d，桉樹人工林凋落物處理的土壤中磷脂脂肪酸總量分別為128.2、122.7和128.3 nmol·g-1，而天然次生林的混合凋落物處理的土壤則為148.2，136.7和140.5 nmol·g-1，分別較桉樹凋落物處理的土壤高16%、11%和9%（圖1d）。

2.3 土壤微生物群落磷脂脂肪酸結構

對土壤微生物群落的磷脂脂肪酸組成進行主成分分析，結果表明：不同凋落物處理土壤微生物群落的磷脂脂肪酸組成存在顯著差異（圖2a）。處理間的差異主要體現在PC1上，PC1能解釋不同土壤微生物群落磷脂脂肪酸變異的84.02%。對PC1得分系數的方差分析結果表明：不同凋落物處理間的差異均達到顯著水平（P＜0.05）；PC2能解釋不同土壤微生物群落磷脂脂肪酸變異的6.73%，不同凋落物處理在PC2上的差異主要體現在添加凋落物處理與對照之間（P＜0.05），而兩種凋落物處理之間的差異不顯著。

圖1 不同凋落物處理土壤微生物群落磷脂脂肪酸的豐度Fig. 1 PLFA abundance in the soil relative to treatment

圖2 不同凋落物處理土壤微生物群落PLFA組成（a）和碳代謝功能（b）的主成分分析Fig. 2 PCA of soil microbial PLFA compositions (a) and carbon metabolic profiles (b) relative to treatment

2.4 土壤微生物群落碳代謝方式

應用主成分分析研究不同凋落物處理下土壤微生物群落對31種單一碳源的利用，發現不同凋落物處理土壤中微生物群落的碳源利用方式表現出明顯分異（圖2b）。PC1能解釋不同土壤微生物群落碳源代謝方式變異的36.99%，對得分系數的方差分析結果表明：不同凋落物處理間的差異都達到顯著水平（P＜0.05）；PC2能解釋不同土壤微生物群落碳源代謝方式變異的16.95%，不同凋落物處理間在PC2上的差異主要表現為天然次生林凋落物處理在PC2的得分系數與桉樹凋落物處理以及對照均存在顯著差異（P＜0.05），但是桉樹凋落物處理與對照之間的差異不顯著。

不同凋落物處理下土壤微生物群落對六大類碳源的利用偏好存在顯著差異（圖3）。添加天然次生林混合凋落物的土壤微生物群落比較偏好、利用率較高的碳源類型為糖類、聚合物類、胺類和氨基酸類，顯著高于對羧酸類和其他類碳源的利用；添加桉樹凋落物的土壤微生物群落對六大類碳源的利用率從高到低依次為：糖類、氨基酸類、胺類 ＞聚合物類 ＞ 羧酸類 ＞ 其他；未添加凋落物的土壤微生物群落對六大類碳源的利用率從高到低則依次為：氨基酸類、胺類 ＞ 糖類 ＞ 聚合物類、羧酸類＞ 其他。

不同凋落物處理下土壤微生物群落對不同類型碳源的利用程度差異非常顯著（圖3）。在整個培養期內，除了胺類以外，不同凋落物處理土壤微生物群落對其他五大類碳源的利用程度存在顯著差異，未添加凋落物的土壤微生物群落對各類碳源的利用程度最低，而天然次生林混合凋落物處理的土壤微生物群落對羧酸類、糖類、聚合物類以及其他四大類碳源的利用程度均顯著高于桉樹凋落物處理，兩種凋落物處理土壤微生物群落對氨基酸類碳源的利用沒有顯著差異。

圖3 不同凋落物處理土壤微生物群落對不同類型碳源的利用Fig. 3 Utilization of carbon source by soil microbial community relative to treatment and type of carbon source under different litters

2.5 土壤微生物群落碳代謝能力

凋落物分解不同階段，土壤微生物群落代謝活性在不同凋落物處理間的差異均表現為：不添加凋落物的對照土壤（CK）顯著低于添加凋落物處理的土壤。而添加桉樹凋落物（EP）的土壤顯著低于添加天然次生林混合凋落物（NSF）的土壤，碳代謝活性從高到低依次為：NSF ＞ EP ＞ CK（圖4a）。

圖4b、圖4c所示為土壤微生物在用BIOLOG生態板培養72 h后所利用碳源的豐富度和Shannon多樣性指數。不同凋落物處理下土壤微生物群落利用碳源的豐富度和多樣性差異顯著。添加凋落物的土壤顯著高于不添加凋落物的對照，兩種凋落物處理之間，又以添加桉樹凋落物的土壤低于添加天然次生林凋落物的土壤，并且在凋落物添加初期（10 d）的差異達到顯著水平（P＜0.05）。

圖4 凋落物分解10、20、30 d后土壤微生物群落碳源代謝活性、豐富度及多樣性Fig. 4 Carbon metabolic activity, richness and diversity of the soil microbial community on D10, D20 and D30 relative to treatment

3 討 論

人類活動包括煉山、翻耕、施除草劑、施肥、伐木等對森林生態系統的干擾較大，且凋落物原位分解會受到微氣候、地上植被等因子的綜合影響，難以明確桉樹凋落物本身對土壤微生物群落的影響，所以本研究采用實驗室縮微模擬試驗，在微氣候條件一致的情況下，選取3種碳、氮含量存在差異的天然次生林土壤，采用隨機區組的實驗設計開展實驗，增強研究結果的可比性和說服力。

不同凋落物處理下土壤微生物群落的磷脂脂肪酸組成和碳代謝功能具有顯著差異。添加桉樹凋落物的土壤，其各類群微生物的磷脂脂肪酸含量以及總量雖然高于未添加凋落物的土壤，但是均顯著低于添加天然次生林混合凋落物的土壤，表明與天然次生林的混合凋落物相比，單一桉樹凋落物為土壤微生物群落提供生境和食物的能力較低，天然次生林的混合凋落物更容易被土壤微生物群落利用從而合成自身的生物量。這一結果與野外觀測的結果相吻合：與天然次生林相比，桉樹人工林土壤微生物群落的生物量碳、氮、各類群微生物以及磷脂脂肪酸總量均顯著降低［13-24］；此外，與添加天然次生林凋落物的土壤相比，桉樹凋落物處理的土壤，無論微生物群落代謝的活性還是碳源利用的豐富度和多樣性均顯著較低，這一結果也與野外觀測的結果相吻合：與天然次生林相比，桉樹人工林土壤微生物群落碳源代謝活性、豐富度和多樣性顯著降低［13-24］。譚宏偉等［4］的研究也發現，桉樹林土壤可培養微生物數量、微生物生物量碳、氮，細菌多樣性和碳氮磷轉化相關酶活性均低于天然闊葉林。

不同凋落物處理導致土壤微生物群落結構和功能產生差異的原因可能與凋落物的物種及化學組成有關。研究區域內的桉樹人工林群落結構單一，喬木層通常只有桉樹一個物種，而天然次生林中植物多樣性高，喬木物種豐富，供試的混合凋落物的物種組成超過了10種，不同質地的凋落物混合在一起可改變凋落物組成，改善凋落物的養分狀況，增加微生物可獲得資源的變異度［25-26］。此外，高碳氮比的凋落物中通常含難降解結構化合物（如木質素等）的比例也較高，可供微生物生長的資源較為貧乏［25-26］。本研究結果顯示桉樹凋落物的碳氮比高達76.29，而天然次生林混合凋落物的碳氮比僅35.16。天然次生林凋落物較低的碳氮比顯著增加了土壤微生物群落生物量、碳代謝活性、多樣性和豐富度。此外，桉樹可能通過凋落物分解過程釋放化感物質，從而影響土壤微生物的生長發育［27］。大量研究發現，桉樹葉片和果實等組織中含有幾十種揮發性組分，如香樹烯、α-水芹烯、1,8-桉葉素、藍桉醇等，具有較強化感作用。這些物質可通過凋落物分解進入土壤，并在土壤中不斷積累，抑制某些微生物的活性［28］。

土壤微生物通過凋落物獲取碳源，天然次生林的混合凋落物和桉樹凋落物完全不同的物種組成也導致其化學成分的改變，尤其是C/N比的增加，因而引起土壤微生物食物種類和成分的變化。由于不同種類土壤微生物對這些變化的反應可能存在差異，并且土壤微生物群落的結構和功能之間存在相互影響［29］，不同凋落物處理下的土壤微生物形成結構和功能差異顯著的微生物群落。本研究用PLFA和BIOLOG方法分別研究了土壤微生物的群落結構和功能，兩種方法得到一致的結果。盡管采用三種土壤碳、氮含量存在顯著差異的土壤進行培養實驗，并且在不同培養時期分別采樣，主成分分析的結果表明凋落物類型依然是導致土壤微生物群落PLFA組成和碳代謝方式產生差異的主要原因，并且PC1PLFA和PC1BIOLOG之間存在顯著相關性（r=0.681，P＜0.001）。表明桉樹可能通過凋落物途徑打破原生植物與土壤微生物之間經過長期歷史形成的平衡的共生關系，形成有利于自身的新的共生關系。

4 結論與展望

土壤微生物是維系陸地生態系統地上-地下相互作用的紐帶。土壤微生物在影響森林物質循環和能量交換的同時，本身也受到地上生態系統的影響。這一點在植物對土壤微生物群落多樣性的影響上尤為突出。本研究中，與天然次生林混合物種的凋落物相比，桉樹人工林單一物種的凋落物擁有完全不同的凋落物養分組成，桉樹凋落物較低的物種多樣性和較高的碳氮比也導致了較低生物量、多樣性和代謝活性的土壤微生物群落。表明桉樹凋落物為土壤微生物群落提供生境和食物的能力低于天然次生林的凋落物。該結果為深入理解桉樹種植對土壤微生物群落的影響及其途徑提供了依據。

本研究僅利用常規的PLFA分析法和BIOLOG微平板技術分析土壤微生物群落結構和功能的特征，這些方法不能完整反映土壤微生物群落的信息。此外，除了凋落物途徑，桉樹種植影響地下微生物群落的途徑還有很多，如根系分泌物、人工林管理等。今后，可采用宏基因組學、轉錄組學和代謝組學等研究手段，圍繞土壤微生物多樣性和功能及其與桉樹根際、桉樹林植物多樣性、土壤特征的關系等方面展開研究，將有助于從不同層面闡明桉樹種植對土壤微生物群落組成及多樣性、豐度、活性及其生態功能的影響。