紫色番茄 SlWD40-like基因克隆與表達分析

張 園 ，徐紹忠 ，毛自朝，林 春，劉正杰

(1.云南農業大學 農學與生物技術學院,昆明 650201； 2.云南省高校作物種質創新及可持續利用重點實驗室,昆明 650201)

WD40結構域首次發現于G蛋白β亞基，WD40蛋白家族一般都含有1個以上的從谷氨酸-組氨酸(Gly-His)開始、到色氨酸-天冬氨酸(Trp-Asp)結尾的WD40結構域，又被稱之為WD-重復(WD-repeat)蛋白[1]。WD40蛋白家族在真核生物中相當保守，基于內部WD40 基序與其他蛋白之間互作(如E3泛素連接酶復合體CUL4-DDB1-DWD[2])，參與多種細胞生物學和生理化學過程，包括信號轉導、細胞轉運、組蛋白甲基化、RNA加工、花的發育和泛素化等[3-5]。

在植物中，WD40蛋白參與多種代謝和調控途徑，包括植物花青素合成與調控、植株形態發育調控，以及各種響應多種非生物脅迫過程等[6]。擬南芥基因組中存在269個含有WD40結構域的基因[7]，研究發現部分基因參與對擬南芥花的形成和種子發育過程的調控[8]，而一些基因在信號轉導過程中有重要作用[9]。研究發現，水稻中SRWD(SALT RESPONSIVE WD40 PROTEIN)亞家族中，有5個成員應答鹽脅迫產生的反應[10]。植物處于在非生物脅迫逆境條件下，在植物體內會產生一系列的生理代謝反應，表現為生長和代謝受抑制，甚至導致植株的死亡，其中鹽堿等逆境危害，是目前普遍存在于自然界導致農業減產的重要因素[11]。

目前，在番茄中已報道發現了100個WD40蛋白亞家族DWD蛋白，這些蛋白的主要作用是作為E3泛素連接酶CUL4復合體中的亞基識別底物[12]。相關研究表明，番茄WD40蛋白可參與響應非生物脅迫的過程，番茄SlWD6基因的過量表達可顯著增強番茄的抗旱和耐鹽功能[13]；SlWDR141基因對鹽脅迫和細菌侵染均起正調控作用[14]。但目前尚未見到有關紫色番茄WD40蛋白功能研究的報道。為了研究紫色番茄中WD40蛋白編碼基因在抗逆方面的作用，應用RT-PCR的方法從紫色番茄品種‘硯紫1號’葉片中克隆了SlWD40-like基因，通過qRT-PCR手段分析目的基因的組織表達特異性，利用qRT-PCR方法明確該基因在逆境脅迫下的表達模式，為該基因的功能鑒定和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

紫色番茄品種‘硯紫1號’由云南省硯山縣蔬菜研究所提供。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α由云南農業大學特色小宗作物研究中心實驗室保存。pMD18-T載體、Taq酶購置于TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生物有限公司。引物合成與測序由上海生物工程有限公司完成。其他試劑分析純購自昆明云科生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 供試樣品總RNA的提取采用天根生物有限公司試劑盒，根據Invitrogen公司提供的反轉錄試劑盒合成cDNA，然后置于-20 ℃保存，用于后續試驗。

1.2.2 紫色番茄SlWD40-like基因克隆 基于文獻報道的與逆境響應相關WD40蛋白編碼基因保守序列(含結構域)，在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對番茄EST庫Blast比對，將獲得的高度相似性的EST序列拼接成較長的復合EST，再以此復合EST為查詢序列再次進行Blast比對和拼接，直到最有效延伸。NCBI在線ORF Finder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測候選基因序列開放閱讀框，設計特異引物(表1)SlWD40F1和SlWD40R1，以葉片cDNA為模板進行PCR擴增，PCR體系參考文獻[15]。擴增條件為：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸8 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠回收純化，然后連接至pMD18-T載體，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，挑取經鑒定的陽性克隆，送樣測序。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primers used in this research

1.2.3SlWD40-like基因編碼的氨基酸序列特征分析 Protparam在線軟件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protpara)預測氨基酸序列等電點和分子量等理化性質；NCBI在線CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd)預測氨基酸序列保守結構域；ProtScale在線軟件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析蛋白質的親水性/疏水性；NetPhos 3.1 Server在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測氨基酸序列翻譯后的磷酸化修飾；SOPMA 在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)預測蛋白質二級結構；DNAman軟件進行氨基酸多序列比對；MEGA7.0構建系統發育樹。

1.2.4 供試材料鹽脅迫處理 挑選飽滿的‘硯紫1號’種子，先浸在涼水中4～5 h，取出后放入質量分數為10%的磷酸三鈉溶液中消毒20 min，取出用清水洗凈，置于培養皿中萌發出苗，然后將幼苗移栽至育苗盤中，于光照培養箱中培養10 d。挑選長勢較為一致且健壯的番茄幼苗，置于1/2 Hoagland營養液中培養5 d，然后在1/2 Hoagland營養液中加入NaCl，使NaCl濃度達到150 mmol·L-1[13]。分別取鹽脅迫處理0、3、6、12、24和48 h的植株的相同部分葉片，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品用液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.5 供試材料干旱脅迫處理 供試材料的前期處理與 “1.2.4”一致。挑選光照培養箱中培養10 d后的健壯番茄植株移栽至花盆，移栽成活后，連續7 d不澆水(此時極度萎蔫)，其中對停水當天(0 d)、1 d、3 d、5 d和7 d及復水1d(Re1d)植株相同部分的葉片取樣，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品速凍于液氮后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.6 供試材料ABA和MeJA處理 供試材料前期處理同“1.2.5”，挑選長勢較為一致且健壯的番茄幼苗30株移栽至花盤，5 d后分別用于ABA和MeJA誘導處理試驗。一組在供試材料葉片噴施100 μmol·L-1的ABA[16]，分別取ABA處理0、1、3、6、12和24 h植株相同部分的葉片，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品速凍于液氮后保存在-80 ℃冰箱。另一組在供試材料葉片噴施200 μmol·L-1MeJA[16]，分別取MeJA處理0、1、3、5、7和9 h植株相同部分的葉片，每個處理時間取3個生物學重復樣品，樣品速凍于液氮后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.7SlWD40-like基因定量Real-time PCR分析 提取紫色番茄根、莖、葉、花、青果和紫果，以及上述不同處理、不同時間的供試樣品的總RNA，反轉錄合成第1條cDNA，以番茄UBI3持家基因(登錄號：X58253)作為內參基因，基于引物qUBI3F1、qUBI3R1和qWD40F1、qWD40R1進行上述組織部位樣品定量Real-time PCR分析，每個反應重復3次，基因相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

1.2.8 數據處理 用Excel 2016軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 SlWD40-like基因的克隆

以紫色番茄cDNA為模板，進行RT-PCR擴增，經電泳、回收、連接、轉化和測序，獲得目的基因序列(圖1)，測序結果表明，目的基因的開放閱讀框(ORF)全長1 383 bp，編碼460個氨基酸殘基，氨基酸序列中包含6個保守的WD40重復基序，屬于典型的WD40基因家族，因此將目的基因命名為SlWD40-like基因。

2.2 SlWD40-like蛋白生物信息學分析

2.2.1 SlWD40-like蛋白理化性質分析 Protparam等在線軟件分析表明，SlWD40-like蛋白分子質量為51.0 ku，分子式為C2242H3505N641O691S16，含有43個負電荷氨基酸殘和53個正電荷氨基酸殘基，理論等電點為9.04；不穩定系數為44.43，屬不穩定型蛋白。由ProtScale工具分析可知，SlWD40-like蛋白親水性區域(分值為負)分值較高，但疏水性區域(分值為正)分值低，因此推測該蛋白屬于親水性蛋白。

M. DNA marker 2000; 1～2. RT-PCR擴增產物 RT-PCR products

圖1SlWD40-like基因RT-PCR擴增
Fig.1RT-PCRamplificationofSlWD40-like

2.2.2 SlWD40-like蛋白序列翻譯后的磷酸化修飾預測 蛋白質磷酸化是蛋白翻譯后最為普遍和常見的一種修飾方式。一般來說，氨基酸鏈中潛在的磷酸化位點越多，則該蛋白能夠發揮重要作用的可能性也就越大[17]。NetPhos軟件在線分析表明,SlWD40-like存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3個磷酸化位點。各個磷酸化位點的數目存在差異，其中絲氨酸磷酸化位點42個，蘇氨酸磷酸化位點15個，酪氨酸磷酸化位點8個。

2.2.3 SlWD40-like蛋白結構分析 NCBI的CDD在線工具預測發現，SlWD40-like蛋白的連續6個WD40重復基序位于開放閱讀框的319～127 5之間，說明SlWD40-like蛋白屬于WD40超級家族。用SOPMA預測表明，SlWD40-like蛋白二級結構含有12.61%的α螺旋，7.17%的β轉角，延伸鏈占28.04%，無規則卷曲占據比例達52.17%。

2.2.4 不同物種間WD40蛋白的同源性與進化分析比較 將紫色番茄SlWD40-like蛋白與潘那利番茄、胡蘿卜、擬南芥等物種中WD40蛋白進行多序列比對，發現物種之間WD40蛋白序列的同源性較高，特別是在重復的WD-repeat區域高度保守(圖2)。將紫色番茄SlWD40-like蛋白與一些雙子葉植物和單子葉植物的WD40蛋白序列進行系統進化分析，發現SlWD40-like蛋白與潘那利番茄的WD40蛋白親緣關系最近，其次是胡蘿卜(圖3)。從整個進化樹結構來看，系統進化分析將所有蛋白序列分為3個分枝(CladeⅠ～CladeⅢ)，其中SlWD40-like蛋白與潘那利番茄和胡蘿卜的WD40蛋白序列在同一個分枝。

2.3 SlWD40-like基因的表達分析

應用熒光定量RT-PCR方法對SlWD40-like基因進行組織特異表達分析表明，SlWD40-like基因在營養器官和生殖器官中均有表達，在營養器官中，根部表達量較低，葉片表達量高，其次是莖；在生殖器官中，花的表達量較低，紫色果實中表達量高，其次是青果(圖4)。為進一步研究SlWD40-like基因是否受非生物脅迫誘導表達，本研究對紫色番茄苗期進行了鹽脅迫、干旱脅迫和外源ABA及MeJA激素處理，研究發現SlWD40-like基因受到NaCl、干旱、ABA和MeJA脅迫誘導：NaCl處理12 h，SlWD40-like基因表達量達到最高，隨后表達量降低；干旱處理條件下，SlWD40-like基因的表達受到干旱處理的顯深藍色、粉紅色、藍色和黃色分別代表同源性水平在100%、75%、50%和33%以上 Dark blue,pink,blue and yellow represent the level of homology at 100%,75%,50% and 33%,respectively；比對的物種為紫番茄 WD40 sequences obtained fromSolanumlycopersicum; 野生番茄Solanumpennellii； 胡蘿卜Daucuscarota; 土瓶草Cephalotusfollicularis; 蓖麻Ricinuscommunis; 陸地棉Gossypiumhirsutum; 毛果楊Populuseuphratica; 擬南芥Arabidopsisthaliana著誘導，特別是3 d和7 d時，表達量達到最高，復水1 d后又有所下降；ABA處理下，SlWD40-like基因表達量在1 h時達到最高，之后基因表達量顯著下降；而在MeJA處理下，SlWD40-like基因表達量在前3 h無顯著變化，但在5 h時達到最高(圖5)。

圖2SlWD40-like與其他物種同源蛋白質的多序列比對
Fig.2Multi-alignmentofSlWD40-likeaminoacidsequencewithotherWD40s

圖3 紫色番茄與其他物種WD40蛋白的系統進化分析Fig.3 Molecular phylogenetic analysis of WD40 proteins from purple tomato and other species

R.根 Roots; S.莖 Stems;L.葉 Leaves;F.花 Flower;GF.青果 Green fruits;PF.紫果 Purple fruits

圖4SlWD40-like基因組織特異表達分析
Fig.4AnalysisoftissuespecificexpressionofSlWD40-likegene

3 討 論

基于同源克隆策略，設計引物進行RT-PCR擴增獲得紫色番茄中SlWD40-like基因cDNA序列，對其序列特征進行分析，發現該基因長度為1 383 bp，編碼1條460個氨基酸多肽。氨基酸序列同源性分析發現，SlWD40-like基因編碼氨基酸序列與潘那利番茄、胡蘿卜、蓖麻和擬南芥等物種中的WD40重復蛋白序列高度同源，因此推測SlWD40-like基因編碼的蛋白為WD40重復蛋白。

WD40蛋白從多種層面參與對植物生命活動的調節[18]。近年來，隨著氣候演變趨于惡劣，鹽堿、干旱、高溫等非生物逆境脅迫對農作物的影響越來越突出與加重[19]，關于探索農作物的抗逆機制的研究也越來越受到重視[20]。諸多研究表明，WD40蛋白參與了各種非生物脅迫的響應，如干旱、鹽以及不同激素的誘導等。研究發現，將棉花GhWD40基因在擬南芥中超量表達可使種子在萌發期對脫落酸(ABA)更加敏感，但在幼苗期對ABA敏感性降低[21]。構建小麥TaWD40D基因干涉載體并轉化小麥后發現，轉基因材料對干旱的耐受性比野生型要低；而將TaWD40D基因過量表達載體轉化擬南芥，則發現轉基因材料對ABA、干旱和鹽等非生物脅迫的耐受性比野生型要高[22]。紅麻HcWD40-1基因受鹽和干旱脅迫誘導表達，同時受脫落酸和茉莉酸甲酯的誘導[20]。黑果枸杞WD40編碼基因LrAN11在鹽脅迫下表達量發生顯著變化，說明該基因可能參與黑果枸杞對鹽脅迫的響應[23]。

該研究發現，SlWD40-like基因表達受NaCl脅迫誘導，特別是在3～12 h期間，基因的表達量逐漸達到最高，隨后表達量開始下降；而在干旱脅迫處理下的第3天和第7天，SlWD40-like基因表達量顯著上調，表明SlWD40-like基因參與了紫色番茄耐鹽和抗旱的應答調控網絡，易受到NaCl和干旱脅迫誘導，這為紫色番茄后續的耐鹽和抗旱調控機制的剖析奠定了研究基礎。研究表明，植物在響應鹽脅迫和干旱的過程中，脫落酸和茉莉酸甲酯等重要的內源激素迅速合成，可通過調節不同的生理生化途徑，包括使葉片氣孔關閉等，來提升植物耐鹽的能力[24]。外源施加ABA能提升內源ABA合成水平，進而促進植物耐受非生物脅迫的能力[25]。在本研究中，對紫色番茄進行外源ABA和MeJA都能夠誘導葉片中SlWD40-like基因表達，特別是在ABA處理1 h和MeJA處理5 h下，均有一個較高的應答反應，基因表達量迅速提高，說明SlWD40-like基因參與了脫落酸和茉莉酸甲酯信號通路下非生物脅迫應答途徑。

圖5 NaCl(A)、干旱(B)、ABA(C)和MeJA(D)脅迫下 SlWD40-like基因的表達量Fig.5 Expression of SlWD40-like gene under stress treatment of NaCl(A),drought(B),ABA(C) and MeJA(D)

前人研究發現，花青素等次生代謝物質在應對各種生物及非生物脅迫方面具有積極意義[26]。該研究中qRT-PCR分析表明SlWD40-like基因屬于組成型基因，但在紫色較深的莖、葉和成熟紫果中表達量較高，這說明SlWD40-like基因的表達可能與紫色番茄花青素的合成存在一定關聯，但SlWD40-like基因的表達與抗鹽性以及花青素含量之間的具體關系與作用機制，還需要后續進一步研究證實。

4 結 論

本研究從紫色番茄中克隆了一個編碼屬于WD40重復蛋白家族的基因SlWD40-like，該基因編碼個460氨基酸，具有6個典型的WD40結構域。該基因在紫色番茄器官中組成性表達，但存在表達量上的差異性；受鹽和干旱脅迫誘導表達，同時受ABA和MeJA的誘導。以上結果表明，SlWD40-like基因同時受上述脅迫誘導表達，可能是ABA和MeJA等信號轉導途徑及鹽和干旱脅迫應答途徑的關鍵樞紐基因，這為紫色番茄耐鹽的脫落酸信號調控網絡的研究提供了一定的理論依據。