先天性甲狀腺發育異常相關致病基因的突變分析*

孔 靜，戴靜宜，龍 偉，楊宇奇，周 紅，虞 斌，秦志強△

(1.南京醫科大學附屬常州婦幼保健院實驗室，江蘇常州 213003；2.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江 212013)

先天性甲狀腺功能減低癥(CH)是一種常見的新生兒內分泌疾病，江蘇地區發病率約為0.05%(1/2 119)[1]，高于國外水平，基本與全國水平持平。盡管CH的篩查和診斷較為成熟，但發病機制研究仍顯不足。國外研究發現，CH根據致病機制的不同，主要分為甲狀腺發育異常和甲狀腺素合成障礙兩種病理類型，其中甲狀腺發育異常是造成先天性CH的最主要原因，約占80%，但其原因尚未闡明，遺傳因素可能占較大比例[2]。本課題組在前期研究基礎上設計了針對甲狀腺發育異常相關致病基因的靶向測序panel，旨在分析江蘇地區甲狀腺發育異常致病基因的突變特點，為探討CH的分子發病機制提供研究基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012-2017年常州市新生兒疾病篩查中心確診的89例CH患者的資料，合并有其他先天性異常的病例未納入本研究。89例CH患者年齡9～51 d，男43例，女46例。本研究經南京醫科大學附屬常州婦幼保健院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1CH確診方案 按照《新生兒疾病篩查技術規范(2010版)》，在新生兒出生72 h之后、充分哺乳6次后足跟采集4個血斑(濾紙片Schleicher &Schuell 903)，血片采集后懸空平置自然干燥成深褐色，并采用時間分辨熒光免疫法測定新生兒足跟血促甲狀腺激素受體(TSH)水平。對TSH≥9 mIU/L的新生兒進行召回復查，對復查結果再次異常或初次篩查TSH≥20 mIU/L的新生兒采集靜脈血，采用化學發光法檢測血清TSH和血清游離甲狀腺素(FT4)的水平。若TSH≥10 mIU/L，FT4<7.77 pmol/L則確診為CH。

1.2.2靶向基因測序 收集CH病例的靜脈血標本，采用QIAamp DNA blood kit試劑盒提取基因組DNA，基于Illumina Truseq Custom Amplicon v1.5 kit設計包含如促甲狀腺素受體(TSHR)、PAX8、甲狀腺轉錄因子1(TTF1)、甲狀腺轉錄因子2(TTF2)、NKX2-5等基因的外顯子及外顯子-內含子交界區域的靶向測序panel，采用Illumina Miseq 2000平臺進行測序。

1.2.3生物信息學分析 通過SnpEff 軟件對結果進行注釋，通過查詢相關文獻報道及ClinVar、dbSNP等數據庫并利用PolyPhen-2、SIFT、Mutation Taster和GERP++對突變進行預測分析，有兩種或兩種以上生物信息學工具認為該突變致病或可能致病時認為該突變是潛在致病突變。dbSNP和ESP6500數據庫中等位基因頻率≥1%的SNP位點未經分析。

2 結 果

2.1測序結果的一般情況 89例CH患者中有19例檢出甲狀腺發育異常致病基因致病突變，70例未檢出相關潛在致病突變，總體突變檢出率為21.35%(19/89)；共檢出23個潛在致病突變，包括17個TSHR突變，2個TTF1突變，2個PAX8突變及TTF2、NKX2-5突變各1個。THRA突變未檢出。19例存在潛在致病突變的CH患者中，有13例存在TSHR突變，2例存在TTF1突變，2例存在PAX8突變，以及存在TTF2、NKX2-5突變各1例。根據突變位點數目統計，有4例CH患者為TSHR基因雙位點突變，其余均為單位點突變。

表1 TSHR基因突變情況

-：無數據;a：未報道突變位點

表2 TTF1、TTF2、PAX8和NKX2-5基因突變情況

-：無數據；a：未報道突變位點

2.2TSHR基因(NM_000369)的突變情況 89例CH患者中共檢出17個TSHR突變，包括4個新突變，結果見表1。有關CH患者TSHR突變的文獻報道較少且散在分布，c.394G>C[3]、c.2252A>G[4]、c.823G>A[4]和c.1270G>T[5]、c.1349G>A[6]突變在中國人群中見報道，與甲狀腺發育不良和異位有關。c.1574T>C[7]和c.1591C>T[8]等在韓國人群或英國人群中見報道，其余突變暫未檢索到與CH有關的文獻報道。

2.3TTF1、TTF2、PAX8和NKX2-5的突變情況 89例CH患者中共檢出2個TTF1突變，2個PAX8突變，以及TTF2、NKX2-5突變各1個(表2)，PAX8基因c.398G>A[9]在日本人群中見報道，因單倍劑量不足致病，其余基因突變均未見報道。

3 討 論

根據已有的研究，甲狀腺發育異常是造成先天性CH的最主要原因，約占80%[10]，多見于女孩(男女比例為1∶2)。其中，1/3病例為甲狀腺缺如，其余為發育不全或在下移過程中停留在異常部位形成易位甲狀腺，導致甲狀腺部分或完全喪失其功能。造成甲狀腺發育異常的原因尚未闡明，遺傳因素可能占較大比例[11]。有研究報道，與發育相關基因的突變與甲狀腺發育異常有關，如TSHR、PAX8、TTF1、TTF2和NKX2-5等基因[12-13]。這些基因在甲狀腺的生長和發育中起著重要的作用，基因突變阻止或破壞了腺體的正常發育，導致異常或缺失的腺體不能產生正常量的甲狀腺激素而致病。

由于導致先天性CH的原因較多，因此篩選其致病基因變的極為困難。以往的研究主要采用連鎖分析(linkage analysis)對先天性CH家系進行分型，篩選在家系中與疾病產生共分離的遺傳標記，進而在候選基因組區域內對所含基因進行Sanger測序，篩查與疾病共分離的突變位點。盡管連鎖分析在實際研究中已經證實可靠有效，但在對于復雜疾病的研究中，卻存在很大的局限性[14]。因為先天性CH絕大多數為散發性病例，家族性遺傳性病例相對較少[15]，因此對于先天性CH這樣的復雜性疾病，采用連鎖分析篩查新的致病基因顯然不太合適，故急需一種可對盡可能多的基因進行分析的高通量測序分析技術。目前已經得到廣泛應用的第2代測序技術(NGS)可同時對一個物種基因組中全部外顯子區域進行測序(exome-seq，外顯子組測序)，直接發現與蛋白質功能變異相關的遺傳突變，故可以用于發現新的先天性CH致病因素，以及研究已知致病因素在人群中頻譜分布。

現有的報道均為針對歐美疾病人群的研究成果。報道認為絕大部分的先天性CH(約80%)是由于TSHR、PAX8、TTF1、TTF2和NKX2-5基因突變導致甲狀腺生成異常而引起的。我國對先天性CH的分子水平研究鮮有報道。本研究采用靶向測序的方法探討江蘇地區CH相關致病基因突變頻譜，結果發現甲狀腺發育異常致病基因致病突變率僅占所有先天性甲狀腺低下癥的21.34%，遠遠低于國外的研究報道。這提示，江蘇地區先天性CH的致病因素與歐美人群相比，可能存在較大的差異。因此，篩選江蘇地區先天性CH的致病基因及致病因素在人群中的頻譜分布，降低疾病的發生頻率十分重要。

本研究在文獻復習的基礎上，研究目前國內外報道的甲狀腺發育異常相關致病基因的熱點突變的外顯子及外顯子-內含子交界區域設計靶向測序panel，包括TSHR、TTF1、TTF2、PAX8、NKX2-5和THRA基因，采用靶向捕獲測序技術進行檢測。研究共發現23個潛在致病突變，包括17個TSHR突變，2個TTF1突變，2個PAX8突變，以及TTF2、NKX2-5突變各1個，THRA突變未檢出。共發現8個新突變，包括4個TSHR突變，1個TTF1突變，2個PAX8突變和1個NKX2-5突變。這對我國CH致病基因突變頻譜數據庫是一個重要的補充。

綜上所述，本研究發現江蘇地區人群中CH相關致病基因突變中約20%與甲狀腺發育異常有關，與國外文獻相比存在較大的地域差異。本研究所建立的靶向捕獲測序技術可以快速有效地為CH患者進行基因診斷與基因治療提供分子標記。