杭白菊提取液對小鼠肝纖維化的保護作用及機制研究

梁育汝，王彩冰，陳由陽，羅紅葉，屠興榮，唐 敏

(右江民族醫學院：1.臨床醫學院；2.應用生理研究室，廣西百色 533000)

杭白菊[Dendranthema mori-folium(Ramat)Tzvel，DM]為菊科植物菊的干燥頭狀花序，是常用的中草藥及生活飲品，其性味甘、苦、微寒，歸肺、肝經，其主要成分有揮發油、氨基酸、類黃酮及維生素B等，具有散風清熱、平肝明目、清熱解毒之功效[1]。近年的研究[2-7]發現，杭白菊有減慢心率、保肝護心、抑菌抗炎、抗氧化、抗腫瘤、防衰老等功能。杭白菊在肝纖維化方面的干預少有文獻報道，為此本實驗應用四氯化碳(CCl4)建立小鼠肝纖維化模型[8]，采用不同濃度杭白菊提取液給小鼠灌胃，檢測肝組織和血清的生化指標和肝組織病理切片，并與臨床用于治療肝病藥物水飛薊賓(用量換算成小鼠用量[9-10])作比較，探討杭白菊對肝纖維化的干預作用及作用機制，為杭白菊的開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級5周齡左右的健康KM小鼠72只，體質重(25±2)g，雌雄各半，由右江民族醫學院動物實驗中心提供(實驗動物生產許可證：SCXK桂2017-0003；實驗動物使用許可證：SCXK桂2017-0004)，分籠飼養，室溫25 ℃左右，自由進食和進水。

1.2藥品、試劑及器械 杭白菊(康美藥業股份有限公司，批號170550751)；CCl4(成都市科龍化工試劑廠，批號20130329)；水飛薊賓膠囊(天津天士力省特制藥有限公司，批號H20040299)；0.9% NaCl注射液(廣西裕源藥業有限公司，批號L16062904)；甲醛(煙臺市雙雙化工有限公司，批號20170701)。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)酶聯免疫試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)酶聯免疫試劑盒、透明質酸(HA)酶聯免疫檢測試劑盒、白細胞介素-6(IL-6)酶聯免疫檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)酶聯免疫試劑盒、丙二醛(MDA)酶聯免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20180105、20180105、20180106、20180106、20180103、20180104)。多功能酶標儀(上壹橋國際貿易有限公司，型號Tristar Lb941)；數碼顯微鏡(麥克奧迪實業集團有限公司，型號BA2100igital)；離心機(上海安亭科學儀器廠，型號安亭 TGL-16G)；電子天平(諸暨市超澤衡器設備有限公司，型號JM-B1003)；三用恒溫水箱(金壇市醫療儀器廠，型號HH-W600)。

1.3杭白菊提取液的制備 取杭白菊干品300 g，用2 000 mL 30 ℃蒸餾水浸泡30 min，文火煮沸2 h，過濾液文火隔水濃縮至500 mL(相當于生藥600 mg/mL)，冷卻后放入4 ℃冰箱保存備用，用時以雙蒸水配成所需濃度的杭白菊提取液。

1.4動物分組與給藥方法 動物適應性飼養1周，分為6組。正常對照組和模型對照組灌胃0.9% NaCl注射液，水飛薊賓組灌胃5.5 mg/mL水飛薊賓，杭白菊低、中、高濃度組分別灌胃杭白菊提取液150、300、600 mg/mL；除正常對照組為0.9% NaCl注射液外，其余均為0.1% CCl4；灌胃和腹腔注射用量均按10 mL/kg。各組小鼠先每天灌胃1次連續1周，接著每天1次的灌胃和腹腔注射隔日交替進行4周，再每天灌胃1次連續1周。末次用藥灌胃前禁食12 h、禁水2 h，在末次用藥灌胃后進行相應指標檢測。

1.5動物標本的制備及肝指數檢測 末次灌胃30 min后以摘除眼球法采血離心分離血清；迅速剖腹取肝放至電子天平記錄肝濕質量(肝指數=肝濕質量/體質量×100%)，取肝右葉浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，脫水、石蠟包埋、蘇木素-伊紅(HE)染色制成組織切片，通過數碼顯微鏡檢查各組小鼠肝臟的組織結構并攝像。1.6小鼠血清ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA水平的檢測 取血清，分別用ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA酶聯免疫檢測試劑盒，通過酶標儀按說明書要求進行操作檢測。

2 結 果

2.1各組小鼠血清ALT、AST水平和肝指數的結果比較 模型對照組和杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT、AST水平均明顯高于正常對照組和水飛薊賓組(P<0.01，P<0.05)；水飛薊賓組的血清ALT和AST均與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)；杭白菊中濃度組的血清AST水平明顯低于杭白菊低和高濃度組(P<0.01)，杭白菊低、高濃度的血清AST水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型對照組、水飛薊賓組和杭白菊低、中、高濃度組的肝指數之間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)，但均明顯低于正常對照組(P<0.01，0.05)。見表1。

2.2各組小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平比較 模型對照組和杭白菊低、中濃度組的血清HA水平明顯高于正常對照組(P<0.01)，杭白菊高濃度組和水飛薊賓組的血清HA水平與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，水飛薊賓組和杭白菊低、中、高濃度組的血清HA水平明顯低于模型對照組(P<0.01)，杭白菊低、中濃度組的血清HA水平明顯高于水飛薊賓組(P<0.01，P<0.05)，杭白菊高濃度組與水飛薊賓組的血清HA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，杭白菊中、高濃度組的血清HA水平明顯低于杭白菊低濃度組(P<0.01，P<0.05)，杭白菊中、高濃度組的血清HA水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型對照組的血清IL-6水平明顯高于正常對照組和水飛薊賓組(P<0.01，P<0.05)，其余各組的血清IL-6水平組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。除水飛薊賓組和杭白菊低、高濃度組的血清SOD水平明顯高于模型對照組(P<0.01)和杭白菊高濃度組的血清SOD活性明顯高于正常對照組(P<0.05)之外，其余各組的血清SOD活性組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。模型對照組的血清MDA水平明顯高于其余各組(P<0.01)，水飛薊賓組的血清MDA水平與正常對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，杭白菊低、中、高濃度組的血清MDA水平明顯高于正常對照組和水飛薊賓組(P<0.01)，杭白菊高濃度組的血清MDA水平明顯低于杭白菊低、中濃度組(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表1 杭白菊提取液對小鼠血清的ALT、AST水平及肝指數的影響

a:P<0.05,b:P<0.01，與正常對照組比較；c:P<0.05,d:P<0.01，與模型對照組比較；e：P<0.05,f：P<0.01，與水飛薊賓組比較；x：P<0.01，與杭白菊低濃度組比較;y:P<0.01，與杭白菊中濃度組比較

2.3肝組織病理切片檢查 正常對照組肝細胞結構清晰，肝細胞形態正常，肝索排列規則，中央靜脈管壁光滑，無肝細胞變性壞死；模型對照組肝細胞結構模糊，細胞質疏松，細胞核體積變小，肝索排列紊亂甚至消失，中央靜脈管腔內堆積大量脫落的壞死肝組織結構，肝細胞變性壞死區域明顯由結締組織代之，以中央靜脈管周邊更為明顯；水飛薊賓組、杭白菊低濃度組和杭白菊中濃度組與模型對照組相比較，前三者的肝細胞結構較為清晰，肝細胞變性壞死數量和區域等均有較大的改善，但中央靜脈管腔內仍見少量的脫落肝組織結構；杭白菊高濃度組明顯與正常對照組相接近。見圖1。

表2 杭白菊提取液對小鼠血清HA、IL-6、SOD、MDA水平的比較

a:P<0.05,b:P<0.01，與正常對照組比較；c:P<0.05,d:P<0.01，與模型對照組比較；e：P<0.05,f：P<0.01，與水飛薊賓組比較；x：P<0.05,y：P<0.01，與杭白菊低濃度組比較;m:P<0.05，與杭白菊中濃度組比較

A:正常對照組;B:模型對照組;C:水飛薊賓組;D:杭白菊低濃度組;E:杭白菊中濃度組；F:杭白菊高濃度組

圖1 各組小鼠肝組織切片(×400)

3 討 論

CCl4進入機體經血液循環到達肝臟生成自由基CCl3-和CCl3O23-破壞肝細胞膜結構，使肝細胞膜磷脂發生脂質過氧化而生成脂質過氧化物(LPO)，致使肝細胞損壞；ALT和AST是胞內酶，當肝細胞損壞時會引起血清中的ALT和AST水平升高，血清ALT/AST比值小于1反映肝纖維化，其比值越低則肝纖維化程度越高；SOD是體內主要的抗氧化酶，它通過清除超氧自由基防止細胞膜脂質過氧化，達到保護細胞膜的完整性，當自由基生成過多或清除能力下降都會引起細胞損壞；MDA是LPO的中間代謝產物，測定MDA水平可反映LPO水平[11-15]。

肝臟的炎性反應和中毒損傷均可引起纖維化；肝纖維化的病理基礎是肝細胞變性壞死被成纖維細胞取代，而成纖維細胞產生膠原沉積于肝結締組織，導致肝纖維化并可演變為肝硬化；HA為膠原成分之一，可較準確靈敏地反映肝內已生成的纖維量及肝細胞受損狀況，HA與肝纖維化的嚴重程度呈正相關[12-13,16]。肝細胞變性壞死將激活肝臟庫普氏細胞釋放多種炎癥因子，IL-6是最主要炎癥因子之一，IL-6作用于肝臟成纖維細胞產生膠原進一步加重肝細胞損傷和肝纖維化[17-18]。

本研究結果顯示：模型對照組的血清ALT/AST比值小于1，HA、IL-6、MDA水平均明顯高于正常對照組，而肝指數明顯低于正常對照組，肝細胞結構模糊，細胞質疏松，細胞核體積變小，肝索排列紊亂甚至消失，中央靜脈管腔內堆積大量脫落的壞死肝組織結構，肝細胞變性壞死區域明顯由結締組織代之；說明本實驗應用CCl4成功建立小鼠肝纖維化模型，提示CCl4導致肝纖維化不僅是由于CCl4生成自由基，同時CCl4也引發肝臟的炎性反應，通過這兩方面共同破壞肝細胞膜使肝臟內細胞變性壞死和膠原沉積所致。

本研究結果也顯示：水飛薊賓組和杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT/AST<1、肝指數下降，前三者的肝細胞結構較模型正常對照組清晰，肝細胞壞死數量和區域等均有較大的改善，但中央靜脈管腔內仍見少量的脫落肝組織結構；杭白菊高濃度組的組織結構明顯與正常對照組相接近；說明這4組小鼠均發生肝纖維化，4組所用藥物均能不同程度地減輕CCl4對肝細胞損傷和肝纖維化。此外，本研究結果還顯示：水飛薊賓組的血清ALT、AST、HA、IL-6、SOD、MDA均與正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)；而明顯低于模型對照組，說明水飛薊賓組發生的肝纖維化程度較小，提示水飛薊賓能有效清除CCl4生成的自由基和改善CCl4引起的炎性反應，從而干預CCl4所致的肝纖維化并起到保護肝細胞膜作用。杭白菊低、中、高濃度組的血清ALT、AST和MDA明顯高于正常對照組而明顯低于模型對照組，血清HA明顯低于模型對照組、前兩者明顯高于正常對照組、后者與正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)；杭白菊低、中、高濃度組血清IL-6既與正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)，也與模型對照組差異無統計學意義(P>0.05)，杭白菊低濃度組的血清SOD明顯高于模型對照組；杭白菊高濃度組的血清SOD明顯高于模型對照組和正常對照組，杭白菊中、高濃度組的血清HA明顯低于杭白菊低濃度組，杭白菊高濃度組的MDA明顯低于杭白菊低、中濃度組；這些說明杭白菊對CCl4所致的肝纖維化有不同程度的改善作用，其既能提高SOD，降低MDA，也能抵制HA生成，雖然血清IL-6與正常對照組差異無統計學意義(P>0.05)，但也與模型對照組差異無統計學意義(P>0.05)，從數值這一角度說杭白菊也在一定程度上抵制CCl4的炎性反應；提示杭白菊可一定程度清除CCl4生成的自由基改善炎性反應，在一定程度上顯示有量效關系。從杭白菊高濃度組的組織切片觀察，肝細胞結構清晰，肝細胞形態正常，肝索排列規則，中央靜脈管壁光滑，無明顯的肝細胞變性壞死，其組織切片與正常對照組相接近，組織切片結構表現明顯優于其血清生化檢測結果反映；提示杭白菊高濃度組對CCl4造成肝纖維化的改善不僅通過消除自由基和抵制炎性反應這兩途徑起作用，很有可能還存在第三條途徑起作用，具體是何途徑有待今后的研究和探討。

綜上所述，CCl4在機體通過生成自由基和引發炎性反應這兩個方面造成肝纖維化；水飛薊賓和杭白菊通過消除機體自由基和炎性反應干預肝纖維化；低濃度和中濃度杭白菊對小鼠肝纖維化模型的各項血清生化指標、肝指數和組織病理切片改善程度劣于水飛薊賓，高濃度杭白菊的各項血清生化指標、肝指數劣于水飛薊賓但組織病理切片優于水飛薊賓的改善效果，由此推測杭白菊干預肝纖維化可能還存在其他途徑。

肝臟是機體的主要解毒器官，它能對機體的有害物質及微生物抗原性物質進行解毒和清除；當肝臟發生纖維化時其解毒功能下降使機體受損[12]。本研究發現，杭白菊具有干預肝纖維化起到保護肝臟的作用，這為杭白菊在臨床上開發應用提供科學依據，也可為肝纖維化患者帶來福音。