miR-193a在肝癌中的表達水平及臨床意義

李寶華，戈海澤，劉樹業(yè)

(天津市第三中心醫(yī)院檢驗科 300170)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種全球常見的惡性腫瘤，也是致死率排名第3的腫瘤，不良預后和高發(fā)病率使它成為世界關注的惡性腫瘤之一[1-2]。目前，臨床上對于早期肝癌的治療方式主要有手術切除和原位肝移植這兩種，但這些療法存在很大的局限性，只對部分患者適用，而且也未能達到預期的療效[3-4]。因此，臨床上需要治療肝癌的新策略。

肝癌的發(fā)病機制是一個極其復雜的過程；研究表明一些致病因子可促使慢性肝炎進一步惡化，并伴隨有基因表達水平和表觀遺傳修飾的改變，這很可能是導致抑癌基因沉默和原癌基因激活的主要原因；在肝癌發(fā)生發(fā)展的過程中某些微RNAs(microRNA,miRNAs)的表達水平也變得異常[5-6]。目前，很多研究想通過基因療法來得到可靠的癌癥檢測指標和治療靶點；但是，這些分子標志物由于很多原因在臨床上并沒用被廣泛應用[7]；因此，這些不足更促使醫(yī)學者們想進一步地了解肝癌的發(fā)病機制。

miRNA是一類廣泛存在于動植物中的單鏈非編碼的小RNA，由內(nèi)源基因編碼，長度在18～22個核苷酸，其主要作用于基因的轉錄后調(diào)控。研究表明，在腫瘤相關的疾病中，miRNA對細胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等起重要的調(diào)控作用[8]，miRNA的表達差異造成了腫瘤的發(fā)展變化。因此，miRNA在癌癥研究方面具有非常重要的意義[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-214[11]和miRNA-491-5p[12]等表達的失調(diào)與肝癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。miRNA可靶向作用特定的抑癌或致癌基因，通過改變它們的表達量來調(diào)控肝癌的進程[10]。本試驗主要探討miR-193a在肝癌組織和癌旁組織中的表達水平，以及其對肝癌細胞Huh7的增殖、遷移、侵襲能力及KRAS表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料 本研究中的肝癌組織和其配對的癌旁組織均取自本院檢驗科。所有標本的獲取都經(jīng)過患者的知情同意，并且得到本院醫(yī)學倫理道德委員會的批準。術后立即將標本置于液氮罐內(nèi)備用。人肝癌細胞Huh7購自上海奧陸生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購于美國HyClone公司；胰酶購于日本Taraka公司；轉染試劑Lipofectamine 2000、TRIzol試劑和反轉錄試劑盒均購于美國Invitrogen 公司；CCK-8購于上海碧云天生物有限公司；實時熒光定量 PCR試劑盒購于瑞士Roche公司；蛋白裂解液RIPA購于北京普利萊基因技術有限公司；KRAS和GAPDH抗體購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染 Huh7細胞用含有10%胎牛血清，100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，分別按照6孔板5×104/孔或者96孔板5×103/孔的量鋪板，18～24 h后按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書轉染，分為miR-NC和miR-193 mimics組，按既定的時間做相關的試驗。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖 細胞轉染0、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，避光培養(yǎng)2 h后測定450 nm處吸光度(OD)值，細胞活性按照CCK-8試劑盒說明書計算并作圖。

1.2.3集落形成試驗 Huh7細胞轉染24 h后收集并計數(shù)，按照500/孔的數(shù)量接種在12孔板內(nèi)，每3天更換培養(yǎng)基1次，大約2周后處理細胞。先用1×PBS清洗1遍，再用結晶紫染料染色并計數(shù)。

1.2.4細胞遷移試驗 Huh7細胞轉染24 h后，將miR-NC和miR-193 mimics組細胞用無血清的DMEM重懸，各取200 μL加到Transwell小室中，每孔5×104個Huh7細胞，下室加600 μL含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，每組設3個復孔，48 h后用4%的多聚甲醛室溫固定并用0.1% 結晶紫染色，拭去未遷移的細胞后拍照并計數(shù)。

1.2.5細胞侵襲試驗 用無血清DMEM以1∶8的比例稀釋Matrigel，用預冷的槍頭吸100 μL加到Transwell 小室中，在細胞培養(yǎng)箱放置1 h使之聚合。后續(xù)試驗步驟同細胞遷移試驗。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測miR-193a mRNA和KRAS mRNA的表達水平 患者組織加液氮研磨后用TRIzol法提取總RNA。轉染后的細胞經(jīng)過48 h后用TRIzol法提取總RNA。用分光光度計檢測總RNA的純度。合格后反轉錄成cDNA，以U6為內(nèi)參進行熒光定量PCR分析，試驗步驟按照試劑盒說明書進行。試驗中所需的引物序列如下：miR-193a 正向引物5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTG CAC TGG ATA CGA CTC ATC TC-3′；反向引物：5′-TGC GGT GGG UCA AAG CGG GC-3′；U6正向引物：5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAGC-3′；U6反向引物：5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′；U6-RT：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA AAA TAT GGA AC-3′；Oligo-dT：5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3′；KRAS正向引物5′-GGG TGT TGA TGA TGC CTT CT-3′；KRAS反向引物5′-TAC TGG CAC TTA GAG GAA-3′。

1.2.7Western blot檢測KRAS蛋白的表達水平 細胞收集后用1×PBS洗1遍，加入RIPA裂解液重懸后冰上裂解30 min，中間再混勻1次，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度定量試劑盒完成濃度檢測。變性后的蛋白用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗(1∶1 000)4 ℃敷過夜，1×TBST洗3遍，每遍10 min；室溫敷二抗(1∶1 000)1 h，1×TBST洗3遍，每遍10 min。最后滴加發(fā)光液并在暗室曝光。

2 結 果

2.1miR-193a在腫瘤組織中表達水平 在GEO數(shù)據(jù)庫中分析miR-193a的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)與相應的癌帝組織比較，miR-193a在肝癌組織中低表達(圖1A)。在TCGA數(shù)據(jù)庫分析異常表達的miR-193a患者的生存率，結果發(fā)現(xiàn)，在miR-193a低表達組(n=573)和高表達組(n=418)中，miR-193a高表達組的個體存活率有所延長(圖1B)。TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果表明，與相應的癌旁組織比較，miR-193a在肝癌組織中是低表達的(圖1C)。本研究對21對肝癌患者的肝癌組織和癌旁組織進行研究發(fā)現(xiàn)，有19例患者的肝癌組織中miR-193a的表達量均低于癌旁組織(圖1D)。這些結果表明，miR-193a在肝癌組織中的表達水平較癌旁組織低。

A：GEO數(shù)據(jù)庫分析結果；B：miR-193a的表達對患者個體生存時間的影響；C：TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果；D：RT-qPCR分析肝癌組織和癌旁組織中miR-193a的表達水平；a:P<0.05,與癌旁組織比較

圖1 miR-193a在腫瘤組織中的表達

A：CCK-8試驗；B：集落形成試驗；C：EdU細胞增殖試驗；a：P<0.05，b：P<0.01,與miR-NC組比較

圖2 miR-193a對不同組Huh7細胞增殖的影響

2.2miR-193a對Huh7細胞增殖能力的影響 Huh7細胞轉染miR-NC和miR-193a mimics后，CCK-8試驗表明，miR-193a mimics組的細胞活性明顯低于miR-NC組(圖2A)。集落形成試驗探討miR-193a對Huh7細胞集落形成能力的影響，試驗結果表明，miR-193a mimics組Huh7細胞的集落形成能力較miR-NC組受到了明顯的抑制(圖2B)。EdU細胞增殖試驗發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組比較，miR-193a mimics組Huh7細胞增殖能力明顯受抑制(圖2C)。上述結果表明miR-193a會降低Huh7細胞的活性和集落形成能力。

2.3miR-193a對Huh7細胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell試驗發(fā)現(xiàn)，miR-193a mimics組中Huh7細胞的遷移和侵襲能力都低于miR-NC組,見圖3。表明高表達miR-193a抑制了Huh7細胞的遷移和侵襲能力。

2.4miR-193a直接靶定并下調(diào)KRAS 為了進一步研究miR-193a作用于Huh7細胞可能相關的分子機制，筆者采用TargetScan human7.1、miRNA.org和miRDB等生物信息學軟件進行分析顯示，KRAS可能是miR-193a的一個候選靶基因(圖4A)。采用RT-PCR和Western blot驗證，結果顯示，miR-193a mimics組KRAS在mRNA和蛋白水平都低于miR-NC組(圖4B、C)。這表明miR-193a抑制了KRAS的表達，進而影響腫瘤細胞的增殖等特性。

A：Transwell試驗檢測miR-193a對Huh7細胞遷移能力的影響；B：Transwell試驗檢測miR-193a對Huh7細胞侵襲能力的影響；a：P<0.05，b：P<0.01，與miR-NC組比較

圖3 miR-193a對不同組Huh7細胞遷移和侵襲的影響

A：生物信息學軟件預測miR-193a可能的靶點；B：miR-193a對KRAS mRNA水平的影響；C：miR-193a對KRAS 蛋白水平的影響；a：P<0.05，b：P<0.01，與miR-NC組比較

圖4 miR-193a對KRAS表達的影響

3 討 論

隨著對miRNA在不同腫瘤或相關疾病中的研究不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA的差異表達與疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，miRNA可能具有抑癌或促癌的作用。例如，miR-144和miR-122-3p分別通過靶向RUNX1和FOXO，使卵巢癌細胞OC和肺癌細胞A549的增殖等特性受到嚴重抑制[13-14]，而miR-1468和miR-451在不同的腫瘤中卻起到促癌作用[15-16]。說明miRNA在將來可能會作為癌癥進程中臨床檢測指標和治療靶點[17]。

很多研究表明，miR-193a可能是1種抑癌的miRNA，與癌細胞的增殖、分化和遷移密切相關[18-19]。已有研究表明，miR-193a在腫瘤中的表達水平明顯低于癌旁組織，且腫瘤細胞的增殖及集落形成能力也被miR-193a所抑制[20]。miR-193a隊具有抑癌作用以外，也有報道稱，在人類胃癌組織和胃癌細胞系中miR-193a的表達水平有所升高，證明它可能在不同的組織中也有促癌作用[21]。因此，研究miR-193a的表達水平及作用是必要的。

本研究探索了miR-193a對肝癌的作用及相關的機制。試驗表明與癌旁組織比較，miR-193a在肝癌組織中的表達顯著降低；通過轉染miR-NC和miR-193a mimics，發(fā)現(xiàn)Huh7細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯被miR-193a表達的升高所抑制。這表明miR-193a起到了抑制肝癌發(fā)展的作用。

為了更進一步的探討miR-193a在肝癌發(fā)展過程中的作用，筆者用生物信息學方法預測了miR-193a的下游靶點為KRAS，RT-PCR和Western blot兩種試驗結果都表明過表達miR-193a后降低了KRAS mRNA和蛋白水平的表達。

綜上所述，本研究證明miR-193a在肝癌中的表達水平有明顯的降低，進而發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用，而這一作用可能是由miR-193a直接靶向KRAS引起的。