酶法提取羊肚菌菌絲體中鮮味物質

□王馨渝 劉 超

一、引言

羊肚菌[Morchella esculenta(L.)Pers.]隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱(Discomycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)。羊肚菌肉質脆嫩，風味獨特，維生素和氨基酸含量豐富，營養和藥用價值較高，是世界公認的珍稀食藥用菌。

氨基酸是構成蛋白質的基本單位,是構建生物機體的眾多生物活性大分子之一，是構建細胞、修復組織的基礎材料。鮮味氨基酸是各種食用菌中主要的鮮味成分，其中,谷氨酸鮮味最為強烈。本文以液體發酵制備的羊肚菌菌絲體為原料，利用外肽酶與外切β-葡聚糖酶水解菌絲體制備鮮味氨基酸(谷氨酸)，為進一步研究液體發酵羊肚菌菌絲體鮮味物質提供理論依據。

二、材料與方法

(一)材料。羊肚菌(Morchellaesculenta)：吉林食用菌研究所提供。

(二)方法。

1.培養基及試劑配制。將去皮洗凈后的200g馬鈴薯切成小塊煮沸30min左右，用四層紗布過濾，馬鈴薯液中加入葡萄糖20g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、瓊脂20g，加入水至1,000mL，混合均勻，滅菌制得固體培養基。

準確稱取的馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、水1,000mL，pH值自然。分裝在250mL三角瓶中，滅菌制得液體培養基。

0.1mol/L檸檬酸水溶液：取檸檬酸晶體(C6H8O7·H2O)2.10g溶于100mL蒸餾水。

1mol/L檸檬酸鈉水溶液：取檸檬酸三鈉晶體(C6H5O7Na3·2H2O)2.94g溶于100mL蒸餾水。

0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉水溶液：溶液將25mL檸檬酸鈉水溶液加入100mL檸檬酸水中，即為125mL的pH=3.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

酶液制備：于緩沖溶液里按照1∶1的比例加入一定量外肽酶與外切β-葡聚糖酶攪拌均勻制得酶液。

2.菌種培養。將滅菌后培養基分裝在固體培養基中，在無菌環境下用接種環挑取羊肚菌菌種，于28℃恒溫培養箱中培養7d。活化后的菌種接種于液體培養基中，置28℃恒溫搖床振蕩培養，轉速130r/min，培養5d得一級種子培養液，再移至6L液體發酵罐中，制備羊肚菌菌絲體。

2.菌絲體處理。取發酵液，以4,000r/min離心20min，得到菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體，收集菌絲體，進行冷凍干燥，備用。

3.高效液相色譜分析鮮味氨基酸。用高效液相色譜儀測定氨基酸組成和含量。色譜條件：安捷倫250mm×4.6mm色譜柱，柱溫40℃，流速1.0mL/min。流動相A：20mmol醋酸鈉；流動相B∶醋酸鈉∶甲醇∶乙腈=1∶2∶2(V)，20mmol。檢測波長：338nm。

4.酶法提取液的制備。精確稱取5.0g原料加入酶液中并攪拌均勻，放入一定溫度的水浴鍋中，在攪拌條件下酶解一定時間。酶解完畢后將酶解提取液放入沸水浴中1～2min使酶失活，離心(4,000r/min)10min。取上清液即為酶解提取液。

5.酶法提取谷氨酸實驗。通過正交試驗考察酶解溫度(40℃、50℃、60℃)、酶解pH(5、6、7)、酶量(0.4%、0.6%、0.8%)、酶解時間(3、3.5、4h)四個因素對菌絲體中鮮味氨基酸(谷氨酸)提取量的影響。提取量以酶解液中谷氨酸含量為指標。

三、結果與分析

(一)高效液相色譜分析鮮味物質。按1.2.3方法，檢測液體發酵羊肚菌菌絲體中含有多種呈鮮物質氨基酸，其中鮮味物質谷氨酸含量最為突出，達到2.564g/100g。

表1 因素水平表

(二)酶法提取工藝優化。根據1.2.5方法，設計正交試驗，其因素與水平如表1所示。

表2 正交試驗設計及結果

由表2的極差分析結果可以看出，四個因素對氨基酸含量的影響大小依次為：pH(B)>酶解時間(D)>加酶量(C)>酶解溫度(A)。其中，pH和酶解時間的影響較為顯著。在試驗設計范圍內，優化得到酶解提取氨基酸的最佳條件為A2B2C2D3，即酶解溫度50℃、pH為6、加酶量0.6%、酶解時間4h，谷氨酸含量為2.091g/100g

四、結語

利用復合酶法對呈鮮氨基酸進行提取能達到較高的提取效果，提取液中谷氨酸含量接近于高效液相色譜檢測的菌絲體中谷氨酸含量。以上實驗表明，通過酶法提取羊肚菌菌絲體中鮮味氨基酸是較為理想的方法，有助于利用發酵技術制備羊肚菌鮮味物質，實現其高質化利用。