不同溫度對三年生三七各部位皂苷含量的影響

周潤澤，王翊豪，周玉厚，朱靈英，鄭國偉，馬曉惠，季鵬章，徐福榮

(云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500)

【研究意義】三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen]為五加科人參屬植物，使用其根和根莖供臨床使用[1]。主產地為中國云南、廣西等省(區)，云南文山是三七的道地產區，文山州的低緯高原生態環境是形成文山三七道地性的決定因素[2]。自古以來三七被普遍應用在多種方劑中，如復方丹參丸、地奧心血康、云南白藥等。近年來，三七除應用在醫藥行業外，也被廣泛用于化妝品和保健品，每年對三七的需求量達到8000 t[3]。當前文山州三七種植面積和產量占全國的98 %，受三七連作障礙的影響，目前三七面臨著無地可種的難題，逐漸從海拔1200～2000 m的地區向更高海拔、高緯度的低溫地區引種，造成其種植帶逐漸向以冬春季極端低溫和易持續低溫天氣為主的北方轉移[4-6]。提高三七的皂苷含量和三七無地可種所造成的種植帶轉移是現階段所面臨的主要問題。【前人研究進展】三七對溫度、光照、濕度、土壤等生態因子十分敏感，生態適應性差，研究表明環境對三七的生長發育及皂苷積累有重要影響[7]。生長/分化平衡(Growth/differentiation balance，GDB)假說、最佳防御(Optimun defense，OD)假說和資源獲得(Resource availability，RA)假說中均表明當植物處于環境脅迫時，其自身次生代謝產物會增加[8-9]。次生代謝產物是中藥中的主要成分，皂苷是三七主要的次生代謝產物，含量約占三七塊根的10 %～12 %[10-11]。溫度可影響藥用植物的光合作用、呼吸作用等生理功能，造成植物體內的有效成分的形成和積累[12]。Oh[13]和劉佳[14]等研究顯示低溫脅迫可顯著增加人參中的總皂苷含量。【本研究切入點】隨著生物醫藥和大健康產業的快速發展，三七的需求量迅猛增加，導致當前三七種植地逐漸向非道地產區外移，然而，有關不同溫度對三七植株不同部位皂苷積累的影響鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本研究針對即將采收的3年生三七，采用人工氣候，設置不同溫度梯度培養30 d，分別對三七的主根、剪口、莖和葉4個部位進行皂苷含量分析，預期闡明不同溫度對三七不同部位皂苷含量的影響，為三七引種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2018年8月12日采自文山州硯山縣三七種植基地，選取生長正常、長勢一致的3年生三七(Panaxnotoginseng)。對照品為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd(HPLC ≥98 %，北京索萊寶科技有限公司)；甲醇(色譜純，SIGMA，USA)；HPLC(型號Agilent1260Ⅱ，USA)。

1.2 實驗方法

將盆栽的3年生三七分別置于10、15和20 ℃人工氣候室內培養30 d，每個處理6株。同時，在基地選取12株生長基本一致的三七作為對照，其中6株于9月12日采收，作為人工氣候室溫度處理的對照材料(CK)，另外6株11月12日采收(采收期組)，用于比較不同采收期三七的皂苷含量。

將不同溫度處理后的3年生三七，以及生長在基地的3年生三七各6株，去泥洗凈。將清洗后三七的主根、剪口、莖和葉4個部分分別置于烘箱內，在40 ℃下將樣品烘干至恒重并研磨成粉，保存備用。

稱取主根、剪口、莖和葉粉末各0.1 g，置于試管內，用甲醇進行溶解，超聲振蕩提取1 h，靜置10 min后，用0.45 μm有機濾膜過濾，所得濾液為供試品。

將對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd混合，加甲醇定容到10 mL。

利用高效液相色譜法進行檢測，并參照2015版藥典有關三七質量檢測的方法[15]。根據對照品溶液濃度的標準曲線計算提取液的濃度。

1.3 統計分析

2 結果與分析

2.1 不同溫度對三七主根中皂苷含量的影響

從表1可知，三七皂苷R1等4種皂苷成分，只有人參皂苷Rg1在不同溫度處理間差異顯著，以20 ℃含量為最高，依次為20 ℃(4.4380 %)> 10 ℃(4.3500 %)> 15 ℃(3.3721 %)> CK(3.0762 %)。三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd各處理間均未呈顯著差異。其中，三七皂苷R1以15 ℃最高，為1.1356 %；人參皂苷Rb1以20 ℃最高，為3.6175 %；人參皂苷Rd以20 ℃最高，為1.1098 %。三七總皂苷含量亦以20 ℃最高，且20 ℃與15 ℃和10 ℃呈顯著差異，20 ℃與CK呈極顯著差異，其含量依次為20 ℃(10.1506 %)> 10 ℃(9.2027 %)> 15 ℃(8.4686 %)> CK(7.5603 %)。綜上表明，20 ℃有利于主根中皂苷含量的積累，其差異主要來源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。

表1 不同溫度下3年生三七主根中皂苷含量

注：同一行數據后不同小寫字母表示0.05水平上，下同。

Note: Data following by small letters in the same line meant significant difference at 0.05 level.The same as below.

表2 不同溫度下3年生三七剪口中皂苷含量

2.2 不同溫度對三七剪口中皂苷含量的影響

從表2可知，剪口中三七皂苷R1等4種皂苷含量在不同溫度處理間均未呈顯著差異。三七皂苷R1以15 ℃最高，為1.9046 %；人參皂苷Rg1以20 ℃最高，為6.7542 %；人參皂苷Rb1以15 ℃最高，為4.7827 %；人參皂苷Rd以15 ℃最高，為1.7422 %。剪口中三七總皂苷含量在不同溫度下差異不顯著，以15 ℃最高，為14.2905 %。

2.3 不同溫度對三七莖中皂苷含量的影響

從表3可知，莖中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1的含量極低，通過HPLC并未檢測出。人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd在不同溫度處理間均未呈現顯著差異；人參皂苷Rb1以CK最高，為0.2895 %；人參皂苷Rd以CK最高，為0.1340 %。莖中三七皂苷亦未呈現顯著差異，其含量為0.4235 %。綜上表明，三七莖中皂苷含量在不同溫度下差異不顯著，以CK的皂苷含量為最高。

2.4 不同溫度對三七葉中皂苷含量的影響

從表4可知，葉中三七皂苷R1通過HPLC未檢出，同時CK組葉中未檢出人參皂苷Rg1。葉中人參皂苷Rb1存在顯著差異，以15 ℃含量最高，20 ℃最低，依次為15 ℃(0.2510 %)>CK(0.2470 %)>10 ℃(01939 %)>20 ℃(0.1199 %)；人參皂苷Rd亦存在顯著差異，以CK含量最高，20 ℃為最低，依次為CK(0.0430 %)>15 ℃(0.0350 %)>10 ℃(0.0321 %)>20 ℃(0.0169 %)；人參皂苷Rg1未呈顯著差異，以15 ℃下含量最高，為0.1573 %；三七總皂苷含量以15 ℃為最高，與CK和10 ℃差異不顯著，與20 ℃差異顯著，依次為15 ℃(0.4433 %)>10 ℃(0.3243 %)>CK(0.2900 %)>20 ℃(0.1957 %)。綜上表明，15 ℃有利于葉中皂苷的積累，其差異主要來源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。

表3 不同溫度下3年生三七莖中皂苷的含量

表4 不同溫度下3年生三七葉中皂苷的含量

圖1 采收期與對照組三七主根總皂苷含量分析Fig.1 Content analysis of total saponins in main root of P. notoginseng during harvest and non-harvest period

2.5 不同采收時期三七主根及剪口中皂苷含量分析

從圖1可知，三七皂苷R1：采收期(1.1901 %)> CK(0.9616 %)，高出23.76 %；人參皂苷Rg1：采收期(3.9943 %)> CK(3.0762 %)，高出29.85 %；人參皂苷Rb1：CK(2.6583 %)> 采收期(2.3375 %)，高出13.72 %；人參皂苷Rd：CK(0.8642 %)> 采收期(0.7579 %)，高出14.03 %；總皂苷：采收期(8.2798 %)> CK(7.5603 %)，高出9.52 %。

從圖2可知，三七皂苷R1：采收期(1.9022 %)> CK(1.8720 %)，高出1.61 %；人參皂苷Rg1：采收期(6.9168 %)> CK(4.9553 %)，高出39.58 %；人參皂苷Rb1：CK(4.4511 %)> 采收期(3.7765 %)，高出17.86 %；人參皂苷Rd：CK(1.5352 %)>采收期(1.5129 %)，高出1.47 %；總皂苷：采收(14.1085 %)> CK(12.8136 %)，高出10.11 %。

三七皂苷R1與人參皂苷Rg1含量呈現增長趨勢，人參皂苷Rb1與人參皂苷Rd含量呈現降低趨勢，但三七總皂苷含量依然是采收期高于提早采收的CK組。因此，三七需適時采收，不宜提早采收。

3 討 論

本研究選取同一產地的3年生三七，對不同溫度處理下的三七主根、剪口、莖和葉的三七皂苷含量積累情況進行分析。結果表明，不同溫度下的三七主根和葉中的皂苷含量存在差異，但剪口和莖對溫度不敏感。

圖2 采收期與對照組三七剪口總皂苷含量分析Fig.2 Content analysis of total saponins in rhizome of P. notoginseng during harvest and non-harvest period

研究發現，4個處理溫度下，三七主根三七總皂苷含量以20 ℃時最高，15和10 ℃三七總皂苷含量也均高于對照組。剪口中的三七總皂苷含量以15 ℃時最高，20和10 ℃時，其所含三七總皂苷也均高于對照組。這與黃璐琦[16]提出的中藥材逆境效應相呼應，一定的低溫有利于三七地下部分三七總皂苷的積累。在4個溫度下，均呈現人參皂苷Rg1>人參皂苷Rb1>三七皂苷R1，與朱潔[17]等研究結果和分析一致。同時，20和10 ℃的主根和剪口均為三七皂苷R1>人參皂苷Rd。綜上，一定的低溫可促進三七總皂苷的積累，但不同的溫度對不同的皂苷積累仍存在差異。

研究發現，4個處理溫度下，3年生三七的莖中測定到的成分為人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd，劉英等[18]研究三七的地上部分主要以20(S)-原人參皂苷二醇型為主與此結果相一致。實驗中測得4種皂苷以人參皂苷Rb1含量最高，白敏等[19]研究也有此結論。三七莖與三七主根皂苷的主要區別在于三七莖中主要含有人參二醇型皂苷[20]。通過分析對照組莖中三七總皂苷高于低溫處理的，這表明低溫會減緩三七莖的生長。

4個溫度處理，15 ℃時三七葉中所含三七總皂苷含量最高，20 ℃時最低。在15 ℃其葉中所含三七皂苷含量高，或與低溫可誘導葉中花色苷合成有關[21]，低溫不僅可誘導花色苷的合成，并可增加葉中皂苷含量。葉中三七總皂苷以人參皂苷Rb1較多，并測得人參皂苷Rg1和人參皂苷Rd。朱潔[17、22]等，利用HPLC-UV測定三七葉，檢測到人參皂苷Rb3、Rc、Rb1和Rd，與本研究中測得人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd相符。

采收期的三七皂苷總含量高于對照，采收期與對照的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的總量分別為采收期(8.18 %)>對照(7.59 %)，均高于2015年版《中華人民共和國藥典》中要求的5 %[15]。崔秀明等[23]研究發現，采收期的三七主根與剪口皂苷含量均高于非采收期的三七，與本研究所得結論相一致。

4 結 論

剪口對溫度不敏感，20 ℃有利于主根中皂苷含量的積累，其差異主要來源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。莖對溫度不敏感，15 ℃有利于葉中皂苷的積累，其差異主要來源于主根中的人參皂苷Rg1含量差異。選擇三七適宜的采收期有利于總皂苷的積累，其主要來源于三七皂苷R1與人參皂苷Rg1含量差異。